ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 ڈوپلیکس ویلڈڈ ٹیوب برائے کیمیکل انڈسٹری کیمیائی جزو ,SPECC1L کی کمی کٹے ہوئے جوڑوں کے استحکام میں اضافہ اور کرینیل نیورل کرسٹ سیلز کی کم شیڈنگ کا باعث بنتی ہے۔

Nature.com پر جانے کا شکریہ۔آپ محدود سی ایس ایس سپورٹ کے ساتھ براؤزر کا ورژن استعمال کر رہے ہیں۔بہترین تجربے کے لیے، ہم تجویز کرتے ہیں کہ آپ ایک اپ ڈیٹ شدہ براؤزر استعمال کریں (یا انٹرنیٹ ایکسپلورر میں مطابقت موڈ کو غیر فعال کریں)۔اس کے علاوہ، جاری تعاون کو یقینی بنانے کے لیے، ہم سائٹ کو بغیر اسٹائل اور جاوا اسکرپٹ کے دکھاتے ہیں۔

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 ڈوپلیکس ویلڈیڈ ٹیوب برائے کیمیائی صنعت

Liaocheng Sihe SS میٹریل کمپنی، لمیٹڈایک سرکردہ صنعت کار ہے جو سٹینلیس سٹیل کے سیملیس پائپوں، روشن اینیلڈ ٹیوبوں، سیملیس کوائلڈ نلیاں وغیرہ میں مہارت رکھتا ہے۔صارفین کی سہولت کے لیے، ہمارے پاس ویلڈیڈ پائپ اور ٹیوبیں بھی ہیں۔Liaocheng Sihe SS میٹریل کمپنی، لمیٹڈسب سے زیادہ جدید پیداوار اور جانچ کا سامان ہے.ہم آپ کی ضرورت کو پوری طرح پورا کر سکتے ہیں۔معیار کے مطابق بہت سختی سے، ہمارے ذریعہ تیار کردہ ٹیوبوں میں ہمیشہ درست OD اور WT رواداری ہوتی ہے۔رواداری کنٹرول سختی سے معیار پیدا کرنے کے مطابق ہے.ہماری مصنوعات ہمیشہ گاہکوں کے ساتھ مطمئن ہیں.صارفین نے ہماری مصنوعات کو خریدا جس سے زیادہ منافع پیدا ہوا۔
a) OD (بیرونی قطر): 3.18 ملی میٹر سے 101.6 ملی میٹر
ب) ڈبلیو ٹی (دیوار کی موٹائی): 0.5 ملی میٹر سے 20 ملی میٹر
ج) لمبائی: گاہک کی ضرورت کے مطابق
d) معیارات: ASTM A312؛ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 وغیرہ
e) طریقہ کار: ERW، EFW وغیرہ

سلائیڈرز فی سلائیڈ تین مضامین دکھا رہے ہیں۔سلائیڈوں کے ذریعے جانے کے لیے پیچھے اور اگلے بٹنوں کا استعمال کریں، یا ہر سلائیڈ سے گزرنے کے لیے آخر میں سلائیڈ کنٹرولر بٹن استعمال کریں۔
کرینیل نیورل کریسٹ سیل (CNCC) برانن کے اعصابی تہوں کو بند کر دیتے ہیں اور فارینجیل آرچز کی طرف ہجرت کرتے ہیں، جو زیادہ تر درمیانی ڈھانچے کی تشکیل کرتے ہیں۔CNCC dysfunction orofacial cleft کی etiology میں ایک اہم کردار ادا کرتا ہے، یہ ایک عام پیدائشی خرابی ہے۔Heterozygous SPECC1L تغیرات atypical اور syndromic clefts والے مریضوں میں پائے گئے ہیں۔یہاں، ہم ثقافتی SPECC1L دستک ڈاؤن خلیوں میں کیننیکل چپکنے والے جنکشن (AJ) اجزاء، β-کیٹنین اور E-cadherin کے بڑھے ہوئے داغ کی اطلاع دیتے ہیں، اور الیکٹران مائکروگراف AJ کے apical-basal بازی کو ظاہر کرتے ہیں۔کرینیو فیشل مورفوجینیسیس میں SPECC1L کے کردار کو سمجھنے کے لیے، ہم نے Specc1l کی کمی والا ماؤس ماڈل بنایا۔ہوموزائگس اتپریورتی جنین مہلک ہوتے ہیں اور نیورل ٹیوب کی خرابی اور CNCC لیمینیشن کی نمائش کرتے ہیں۔اتپریورتی اعصابی تہوں میں AJ پروٹین کے داغ میں اضافہ ہوتا ہے۔AJ کی یہ خرابی CNCC delamination میں خرابی کے ساتھ مطابقت رکھتی ہے، AJ تحلیل کی ضرورت ہوتی ہے۔اس کے علاوہ، Speccc11 اتپریورتیوں نے PI3K-AKT سگنلنگ کو کم کیا ہے اور apoptosis میں اضافہ کیا ہے۔وٹرو میں، جنگلی قسم کے خلیوں میں PI3K-AKT سگنلنگ کی ہلکی روکنا AJ تبدیلیوں کو دلانے کے لیے کافی تھا۔اہم بات یہ ہے کہ SPECC1L دستک ڈاؤن کے ذریعے پیدا ہونے والی AJ تبدیلیوں کو PI3K-AKT پاتھ وے کو چالو کر کے تبدیل کیا جا سکتا ہے۔ایک ساتھ لے کر، یہ اعداد و شمار بتاتے ہیں کہ SPECC1L، PI3K-AKT سگنلنگ اور AJ بیالوجی کے ایک نئے ریگولیٹر کے طور پر، نیورل ٹیوب کی بندش اور CNCC استحکام کے لیے ضروری ہے۔
کرینیئل نیورل کرسٹ سیل (CNCCs) ڈورسل نیورو ایکٹوڈرم میں مقامی بنتے ہیں اور اپکلا-میسینچیمل ٹرانزیشن (EMT) 1,2,3 پر مشتمل عمل کے ذریعے ترقی پذیر عصبی تہوں کے نیوروپیتھیلیم سے الگ ہوجاتے ہیں۔پریمیگریٹنگ اپیٹیلیئل CNCCs انٹر سیلولر جنکشن میں خلل ڈالتے ہیں اور ہجرت کرنے والے mesenchymal CNCCs بن جاتے ہیں جو پہلے اور دوسرے فارینجیل آرچ کو بھرتے ہیں اور زیادہ تر کرینیو فیشل کارٹلیج بناتے ہیں۔اس طرح، سی این سی سی کے فنکشن کو منظم کرنے والے جین اکثر کرینیو فیشل پیدائشی بے ضابطگیوں جیسے اوروفیشل کلیفٹس کی ایٹولوجی میں خلل ڈالتے ہیں، جو عام طور پر صرف امریکہ میں 1/800 پیدائشوں کو متاثر کرتے ہیں۔پیدائشی خرابیوں میں سے ایک 8۔
CNCC کا ڈیلامینیشن چوہوں میں برانن کی نشوونما کے 8.5 اور 9.5 دنوں کے درمیان اینٹریئر نیورل ٹیوب کے بند ہونے کے ساتھ موافق ہے۔متعدد ماؤس اوروفیشل کلیفٹ سے وابستہ جینوں کے اتپریورتی اعصابی ٹیوب کی خرابی کی کچھ شکلیں بھی ظاہر کرتے ہیں، بشمول Irf69,10، Ghrl310، Cfl111، اور Pdgfrα12۔تاہم، نیورل ٹیوب کی بندش اور CNCC سٹرٹیفیکیشن کے عمل کو آزاد سمجھا جا سکتا ہے، کیونکہ Splotch mutant mouse (Pax3) CNCC سٹریٹیفیکیشن یا ہجرت 13,14 پر کسی اثر کے بغیر نیورل ٹیوب کی بندش میں نقائص کو ظاہر کرتا ہے۔CNCC ڈسیکشن اور نیورل ٹیوب کی بندش میں نقائص کے ساتھ اضافی ماؤس ماڈل ان دو عملوں کی مشترکہ مالیکیولر بنیاد کو بیان کرنے میں مدد کریں گے۔
نیوروپیتھیلیل خلیوں سے CNCC کو الگ تھلگ کرنے کے لیے چپکنے والے جنکشنز (AJs) کی تحلیل کی ضرورت ہوتی ہے، جو پروٹین کمپلیکس پر مشتمل ہوتے ہیں، دوسروں کے درمیان، E-cadherin، β-catenin، α-E-catenin، اور α-actinin ایکٹین فلامینٹس 2 سے منسلک ہوتے ہیں۔ عصبی تہوں میں اوور ایکسپریشن اسٹڈیز E-cadherin نے CNCC delamination میں کمی یا تاخیر کو ظاہر کیا۔اس کے برعکس، E-cadherin کو دبانے کے نتیجے میں ابتدائی سطح بندی 15,16 ہوتی ہے۔CNCC کے استحکام کے دوران EMT میں ثالثی کرنے والے بہت سے عوامل ٹرانسکرپشن فیکٹرز (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) اور ایکسٹرا سیلولر میٹرکس (ECM) کو دوبارہ بنانے والے پروٹین جیسے میٹرکس میٹالوپروٹیناسز (MMPs) ہیں، تاہم CNCCs براہ راست cytoskeleators ہیں۔ ابھی تک معلوم نہیں.PI3K-AKT راستہ E-cadherin کی سطح کو مخالف کرنے کے لیے جانا جاتا ہے، بنیادی طور پر کینسر کی تحقیق17 سے۔حالیہ مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ چوہوں میں PDGFα پر مبنی PI3K-AKT سگنلنگ کا نقصان کرینیو فیشل اسامانیتاوں کا باعث بنتا ہے، بشمول درار تالو اور نیورل ٹیوب کے نقائص12۔تاہم، PI3K-AKT پاتھ وے اور CNCC کی سطح بندی پر AJ استحکام کے درمیان تعلق واضح نہیں ہے۔
ہم نے پہلے SPECC1L کی شناخت دو لوگوں میں پہلے اتپریورتی جین کے طور پر کی تھی جس میں شدید درار ہے جو منہ سے آنکھ تک پھیلا ہوا ہے، جسے ترچھا درار (ObFC) یا Tessier IV18 cleft کہا جاتا ہے۔SPECC1L اتپریورتنوں کی شناخت دو کثیر نسلی خاندانوں میں آٹوسومل ڈومیننٹ Opitz G/BBB سنڈروم (OMIM #145410) کے ساتھ کی گئی ہے، جس میں متاثرہ افراد میں ہائپر ڈسٹنس اور کلیفٹ ہونٹ/palate19، اور Tibi overdistance سنڈروم والے ایک خاندان میں (OMIM #145410) .Opitz G/BBB سنڈروم کے آدھے سے زیادہ کیسز X-linked (OMIM #300000) ہیں اور MID1 جین میں تغیرات کی وجہ سے ہوتے ہیں، جو مائکروٹوبول سے وابستہ سیل کنکال کے پروٹین 22 کو انکوڈ کرتا ہے۔ہم یہ قیاس کرتے ہیں کہ SPECC1L، مائکروٹوبولس اور ایکٹین سائٹوسکلٹن سے وابستہ ایک پروٹین بھی، سیل آسنجن اور ہجرت 18 کے دوران ایکٹین سائٹوسکلٹن کو دوبارہ بنانے کے لیے درکار سگنلنگ میں ثالثی کر سکتا ہے۔ان وٹرو اور ان ویوو اسٹڈیز کے ذریعے، اب ہم SPECC1L کو PI3K-AKT سگنلنگ کے ذریعے AJ استحکام کے ایک نئے ریگولیٹر کے طور پر بیان کرتے ہیں۔سیلولر سطح پر، SPECC1L کی کمی کے نتیجے میں پین-AKT پروٹین کی سطح میں کمی واقع ہوئی اور AJ کے apical-basal dispersion میں اضافہ ہوا، جسے AKT پاتھ وے کی کیمیائی ایکٹیویشن سے ختم کر دیا گیا۔Vivo میں، Specc11 کی کمی والے ایمبریوز نیورل ٹیوب کی خرابی اور کم CNCC ڈسیکشن کو ظاہر کرتے ہیں۔اس طرح، SPECC1L انتہائی ریگولیٹڈ سیل آسنجن پر مبنی سگنلنگ میں کام کرتا ہے جو چہرے کے مورفوگنیسیس کے دوران عام CNCC فنکشن کے لیے ضروری ہے۔
سیلولر سطح پر SPECC1L کے کردار کو نمایاں کرنے کے لیے، ہم نے SPECC1L18 میں پہلے بیان کردہ مستحکم آسٹیوسارکوما سیل لائن U2OS کی کمی کا استعمال کیا۔SPECC1L (kd) دستک کے ساتھ ان مستحکم U2OS خلیات میں SPECC1L ٹرانسکرپٹس اور پروٹینز کی سطح میں ایک اعتدال پسند (60–70%) کمی تھی، ساتھ ہی ایکٹین سائٹوسکلٹن 18 کی منتقلی اور تنظیم نو میں نقائص بھی تھے۔ اس کے برعکس، ایک شدید عارضی کمی SPECC1L کو مائٹوٹک نقائص 23 کا باعث دکھایا گیا ہے۔مزید خصوصیت کے بعد، ہم نے پایا کہ ہمارے مستحکم SPECC1L-kd خلیات سنگم کی ایک بہت ہی اعلی ڈگری پر مورفولوجی کو تبدیل کرتے ہیں (شکل 1)۔کم سنگم پر انفرادی کنٹرول سیل اور کے ڈی سیل ایک جیسے نظر آتے تھے (شکل 1A، D)۔فیوژن کے 24 گھنٹے بعد، کنٹرول سیلز نے اپنی کیوبائیڈل شکل کو برقرار رکھا (تصویر 1B، E)، جبکہ SPECC1L-kd خلیات لمبے ہوئے (تصویر 1C، F)۔سیل کی شکل میں اس تبدیلی کی حد کو کنٹرول سیلز اور کے ڈی سیلز کی ویوو لائیو امیجنگ (فلم 1) کے ذریعے حاصل کیا گیا تھا۔سنگم خلیوں میں SPECC1L کے کردار کا تعین کرنے کے لیے، ہم نے پہلے اس کے اظہار کی جانچ کی۔ہم نے پایا کہ فیوژن (شکل 1G) پر SPECC1L پروٹین کی سطح میں اضافہ ہوا، جبکہ SPECC1L ٹرانسکرپٹ کی سطح میں اضافہ نہیں ہوا (شکل 1H)۔اس کے علاوہ، جیسا کہ سیل کی کثافت میں اضافہ ہوا، SPECC1L پروٹین انٹر سیلولر حدود (تصویر 2A-E) پر جمع ہوتا ہے، جس کا نمونہ جھلی سے وابستہ β-کیٹنین (تصویر 2A'-E') کے ساتھ اوورلیپ ہوتا ہے۔ایکٹین سائٹوسکلٹن 18,23 کے ساتھ SPECC1L کی وابستگی کو دیکھتے ہوئے ہم نے قیاس کیا کہ SPECC1L ایکٹین پر مبنی چپکنے والے جنکشن (AJ) کے ساتھ تعامل کرتا ہے۔
(AF) SPECC1L ناک ڈاؤن (DF) خلیات U2OS سیلز (AC) کے مقابلے میں اونچے سنگم (F) پر لمبے ہوتے ہیں۔یہاں چھ ٹائم پوائنٹس میں سے تین دکھائے گئے ہیں (T1, T3, T6) جنہیں ہم نے سیل کی مختلف کثافتوں کے لیے منتخب کیا ہے۔(G) مغربی دھبے کا تجزیہ یہ ظاہر کرتا ہے کہ SPECC1L پروٹین کو کنٹرول سیلز میں کم درجے کے سنگم کے مقابلے میں اعلیٰ درجے کے سنگم پر مستحکم کیا جاتا ہے۔SPECC1L کا مغربی دھبہ متوقع 120 kDa بینڈ اور ایک اعلی مالیکیولر ویٹ بینڈ دکھاتا ہے، ممکنہ طور پر ترجمہ کے بعد ترمیم شدہ (*)۔مغربی دھبے کا تجزیہ کم اور اعلی سنگم کے لئے ایک ہی حالات میں کیا گیا تھا۔SPECC1L کو کم اور اونچے سنگم پر دکھائے جانے والی تصاویر اسی دھبے سے لی گئی تھیں۔اسی دھبے کو ہٹا دیا گیا اور β-ایکٹین اینٹی باڈی کے ساتھ دوبارہ جانچ پڑتال کی گئی۔(H) مقداری RT-PCR تجزیہ نے SPECC1L ٹرانسکرپٹ کی سطحوں میں کوئی خاص تبدیلی نہیں دکھائی۔خرابی والی سلاخیں چار آزاد تجربوں سے SEM کی نمائندگی کرتی ہیں۔
(AE) ہم نے چھ ٹائم پوائنٹس (T1-T6) کا انتخاب کیا جو سیل کی شکل کے تجزیہ کو معمول پر لانے اور SPECC1L ناک ڈاؤن (kd) کے ساتھ U2OS سیلز میں AJ تبدیلیوں کے لیے سیل کی کثافت کی ایک حد کی نمائندگی کرتا ہے۔ان ٹائم پوائنٹس میں سے پہلے پانچ میں سنگل سیلز (T1)، چھوٹے سیل کلسٹرز (T2) کا 50-70% فیوژن، kd سیلز (T3) کو ری شیپ کیے بغیر فیوژن، kd سیلز (T4) کو نئی شکل دینا، اور 24 گھنٹے کی تبدیلیاں شامل ہیں۔kd (T5) خلیوں کی پچھلی شکل میں۔SPECC1L پروٹین بنیادی طور پر T1 (A) پر سائٹوپلازم میں منتشر ہوا تھا، لیکن اس کے جمع ہونے کا مشاہدہ بعد کے ٹائم پوائنٹس (B–E، تیر) پر انٹر سیلولر حدود میں کیا گیا۔(FJ) β-کیٹنین AJ کمپلیکس سے وابستہ انٹر سیلولر حدود میں اسی طرح کے جمع ہونے کو ظاہر کرتا ہے۔(A'-E') SPECC1L اور β-catein اعلی سیل کثافت (تیر) پر سیل کی سرحدوں پر اوورلیپنگ داغ دکھاتے ہیں۔(F'-J') SPECC1L-kd خلیات میں، β-کیٹنین کا داغ کم خلیے کی کثافت (F'-H') پر عام دکھائی دیتا ہے، لیکن خلیے کی شکل میں تبدیلی کے ساتھ پھیلتا ہے (I', J'؛ تیر)، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ AJ بدل گئے ہیںبارز = 10 µm۔
اس کے بعد ہم نے AJ پر SPECC1L کی کمی کے اثر کا تعین کرنے کی کوشش کی۔ہم نے کئی AJ سے وابستہ مارکر استعمال کیے، جن میں کینونیکل اجزاء F-actin، myosin IIb، β-catein، اور E-cadherin24,25,26,27 شامل ہیں۔SPECC1L-kd خلیوں میں ایکٹین تناؤ کے ریشوں میں اضافہ ہوا جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے (تصویر 3A،B) 18۔ایکٹین فلیمینٹس سے وابستہ Myosin IIb نے وٹرو میں SPECC1L-kd خلیوں میں اسی طرح کا اضافہ دکھایا (تصویر 3C،D)۔AJ سے وابستہ β-catein سیل کی جھلی پر کیڈیرن سے منسلک ہوتا ہے، جو کنٹرول کیوبائٹس میں ایک عام "شہد کے چھتے" کے اظہار کا نمونہ دکھاتا ہے (تصویر 3E،G)۔دلچسپ بات یہ ہے کہ کنفوکل مائیکروسکوپی کا استعمال کرتے ہوئے فلیٹ امیجز میں β-کیٹنین (تصویر 3E,F) اور E-cadherin (Fig. 3G,H) سنگم SPECC1L کی کمی والے خلیوں کی سیل جھلی پر داغ دھبے میں توسیع شدہ داغ کے نمایاں نمونے دکھائے گئے۔Kd خلیوں میں AJ سے وابستہ β-catein کے داغ کی یہ توسیع سنگم پر سب سے زیادہ واضح تھی، لیکن یہ خلیے کی شکل میں تبدیلیوں سے پہلے دکھائی دیتی ہے (تصویر 2F-J، F'-J')۔اس توسیع شدہ AJ داغ کی جسمانی نوعیت کا تعین کرنے کے لیے، ہم نے ٹرانسمیشن الیکٹران مائکروسکوپی (TEM) (شکل 3I، J) کے ذریعے SPECC1L-kd U2OS خلیوں کی apical-basal سطح پر سیل کی سرحدوں کی جانچ کی۔کنٹرول سیلز (تصویر 3I) کے برعکس، جس میں AJ (تیر) کے الگ الگ الیکٹران گھنے علاقے تھے، kd خلیات (تصویر 3J) نے apicobasal جہاز کے ساتھ ساتھ AJ کے اعلی الیکٹران کثافت کے اشارے کے بڑے، متصل خطوں کو دکھایا۔.اس کے علاوہ، ٹرانسورس سیکشنز پر، ہم نے کے ڈی سیلز (تصویر S1A،B) میں سیل میمبرین فولڈز کا مشاہدہ کیا، جو β-کیٹنین اور ای-کیڈیرن سٹیننگ بینڈز (تصویر 3F، H) کے توسیعی نمونے کی وضاحت کرتا ہے۔AJs میں SPECC1L کے کردار کی حمایت میں، β-catein کو SPECC1L کے ساتھ مل کر U2OS خلیات (تصویر 3K) کے لائسیٹس میں امیونوپریسیپیٹیٹ کیا گیا تھا۔AJ مارکر کے لیے توسیعی امیونوسٹیننگ کے ساتھ ساتھ، TEM تجزیہ ہمارے مفروضے کے مطابق تھا کہ SPECC1L کی کمی AJ apical-basal density اور variance کو بڑھاتی ہے۔
(اے ایچ) فیوژن کے بعد 48 گھنٹے (T6؛ A، B) میں کے ڈی خلیوں میں ایف ایکٹین کے داغ میں اضافہ۔F-actin (C, D) سے وابستہ myosin IIb کا تبدیل شدہ داغ۔SPECC1L-kd (F، H) خلیوں میں کنٹرول سیلز (E، G) میں β-کیٹنین اور E-cadherin جھلی کے داغ کے ہموار نمونے کو بڑھایا گیا تھا۔بارز = 10 µm۔(I-J) الیکٹران مائیکرو گرافس جو اپیکل بیسل انٹر سیلولر جنکشن کا مشاہدہ کرتے ہیں۔کنٹرول سیل الگ الگ الیکٹران گھنے علاقے دکھاتے ہیں جو چپچپا جنکشن (I، تیر) کی نشاندہی کرتے ہیں۔اس کے برعکس، SPECC1L-kd خلیات میں پورا apical-basal junction الیکٹران ڈینس (J، تیر) ظاہر ہوا، جو کہ چپکنے والے جنکشن کی کثافت اور پھیلاؤ کو ظاہر کرتا ہے۔(K) β-کیٹنین کو سنگم U2OS سیل لائسیٹس میں SPECC1L کے ساتھ مشترکہ مدافعتی بنایا گیا تھا۔چار آزاد تجربوں میں سے ایک کی نمائندگی کرنے والی ایک جگہ سے لی گئی تصویر۔
کرینیو فیشل مورفوگنیسیس میں SPECC1L کے کردار کو سمجھنے کے لیے، ہم نے دو آزاد ES ٹریپ سیل لائنوں، DTM096 اور RRH048 (BayGenomics، CA) کا استعمال کرتے ہوئے ایک Specc1l کی کمی والا ماؤس ماڈل بنایا، جو کہ intron 1 کی نمائندگی کرتے ہیں اور Specc1l ٹرانسکرپٹس Fig15 پر پکڑے گئے تھے۔ .4A، شکل S2)۔ڈیکو ویکٹر داخل کرنے کے جینومک مقام کا تعین پورے جینوم کی ترتیب سے کیا گیا تھا اور پی سی آر (تصویر S2) سے اس کی تصدیق کی گئی تھی۔دونوں جین ٹریپ ڈیزائنوں نے پکڑنے پر Specc11-lacZ رپورٹرز کے ان فریم فیوژن کی بھی اجازت دی۔لہذا ، X-gal داغ کے ذریعہ طے شدہ lacZ اظہار کو Specc11 اظہار کے اشارے کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔دونوں ایللیس نے ایک جیسے lacZ اظہار کے نمونے دکھائے، جس میں انٹرن 1 میں DTM096 جین ٹریپ انٹرن 15 میں RRH048 سے زیادہ مضبوط اظہار دکھاتا ہے (نہیں دکھایا گیا)۔تاہم، Specc1l کا وسیع پیمانے پر اظہار کیا جاتا ہے، خاص طور پر E8.5 (شکل 4B) پر اعصابی تہوں میں، E9.5 اور E10.5 (شکل 4C، D) میں اعصابی ٹیوب اور چہرے کے عمل میں، اور اعضاء کی نشوونما میں۔ E10 پر۔5 اور آنکھیں (شکل 4D)۔ہم نے پہلے اطلاع دی تھی کہ E10.5 پر پہلے فارینجیل آرک میں SPECC1L اظہار CNCC نسب کے مطابق اپیٹیلیم اور بنیادی mesenchyme18 میں موجود تھا۔CNCC میں SPECC1L اظہار کو جانچنے کے لیے، ہم نے E8.5 نیورل فولڈز (شکل 4E-J) اور E9.5 کھوپڑی کے حصے (شکل 4K-) انجام دیے۔E8.5 پر، SPECC1L نے عصبی تہوں کو شدت سے داغ دیا (تصویر 4E، H)، بشمول NCC مارکر سے داغے ہوئے خلیات (تصویر 4G، J)۔E9.5 پر، SPECC1L (تصویر 4K، N) AP2A (تصویر 4L، M) یا SOX10 (تصویر 4O، P) کے ساتھ ہجرت کرنے والے CNCC کو مضبوطی سے داغدار کرتا ہے۔
(A) ماؤس اسپیک 11 جین کی اسکیمیٹک نمائندگی ES DTM096 (انٹرون 1) اور RRH048 (انٹرون 15) سیل کلون میں ڈیکو ویکٹر کے اندراج کو ظاہر کرتی ہے۔(BD) E8.5 سے E10.5 تک Specc1l اظہار کی نمائندگی کرنے والے heterozygous Specc1lDTM096 ایمبریو کا lacZ داغ۔NE = neuroectoderm، NF = اعصابی تہہ، PA1 = پہلا فارینجیل آرچ۔(EP) E8.5 (NF؛ EJ) نیورل فولڈز اور E9.5 (KP) کھوپڑی کے حصوں میں NCC مارکر AP2A اور SOX10 کے ساتھ SPECC1L امیونوسٹیننگ۔SPECC1L داغدار ہونے کا بڑے پیمانے پر نیورل فولڈز E8.5 (E، H؛ تیر کے نشانات) میں مشاہدہ کیا گیا، بشمول AP2A (F، G؛ تیر کے نشانات) اور SOX10 (I، J؛ تیر کے نشانات) کے لیبل والے خلیات۔E9.5 پر، SPECC1L نے AP2A (L, M; تیر) اور SOX10 (O, P; تیر) کا لیبل لگا ہوا منتقلی CNCCs (K, N; تیر) کو مضبوطی سے داغ دیا۔
heterozygous Specc1lDTM096/+ اور Specc1lRRH048/+ چوہوں کے درمیان کراس کرنا یہ ظاہر کرتا ہے کہ دو جین ٹریپ ایلیلس ایکمکمل نہیں ہیں اور یہ کہ کمپاؤنڈ heterozygotes اور embryonic homozygotes یا تو جین ٹریپ ایلیل کے لیے ایمبریونک مہلک ہیں (ٹیبل S1)۔مینڈیلین تناسب نے پیدائش کے وقت ہیٹروزائگوٹس کی بقا کی شرح میں کمی کی نشاندہی کی (متوقع 1.34 بمقابلہ 2.0)۔ہم نے heterozygotes میں کم پیدائشی اموات کو نوٹ کیا، کچھ میں craniofacial anomalies (تصویر S3) تھی۔تاہم، ان پیرینیٹل کرینیو فیشل فینوٹائپس کا کم دخول ان کے بنیادی پیتھوفزیولوجیکل میکانزم کا مطالعہ کرنا مشکل بناتا ہے۔لہذا، ہم نے ہوموزائگس اسپیک 11 اتپریورتیوں کے برانن مہلک فینوٹائپ پر توجہ مرکوز کی۔
زیادہ تر کمپاؤنڈ heterozygous یا homozygous Specc1lDTM096/RRH048 اتپریورتی جنین E9.5–10.5 (Figs. 5A–D) کے بعد تیار نہیں ہوئے، اور نیورل ٹیوب پہلے سے بند نہیں ہوئی (Figs. 5B, D) اور کبھی کبھی پیچھے سے بند ہوئی (نہیں دکھایا گیا) ..یہ کرینیل نیورل ٹیوب بند ہونے کی خرابی E10.5 پر نیورل فولڈز میں باقی CNCC نشان زد DLX2 کی اکثریت کے ساتھ منسلک تھی، جس سے کوئی اخراج نہیں ہوتا ہے (شکل 5A'-D')۔اس بات کا تعین کرنے کے لیے کہ آیا CNCC کا مجموعی سائز بھی کم کیا گیا تھا، ہم نے Wnt1-Cre اور ROSAmTmG کے ساتھ اپنی جین ٹریپ لائنوں میں GFP کے ساتھ CNCC لائنوں کو ٹیگ کیا۔ہم ترتیب شدہ GFP+ NCC اور GFP- (RFP+) نان این سی سی کو پورے ایمبریو سے سٹریم کرتے ہیں۔E9.5 پر، WT اور اتپریورتی ایمبریو (دکھائے نہیں گئے) کے درمیان بہاؤ کی ترتیب والے GFP کے لیبل والے CNCCs کا تناسب نمایاں طور پر تبدیل نہیں ہوا، جو کہ CNCC کی عمومی تفصیلات کی نشاندہی کرتا ہے۔لہذا، ہم نے یہ قیاس کیا کہ بے نقاب نیورل فولڈز (فگر 5B') میں بقایا Wnt1-Cre اور DLX2 داغ داغدار CNCC لیئرنگ کی وجہ سے تھا، ممکنہ طور پر AJ خلیوں کی کثافت یا پھیلاؤ کی وجہ سے، جیسا کہ SPECC1L-kd خلیوں میں دیکھا گیا ہے۔ہم نے عصبی تہہ (شکل 5E-R) میں CNCC کی موجودگی کی تصدیق کے لیے NCC مارکر SOX10، AP2A، اور DLX2 کا استعمال کیا۔E8.5 پر، تینوں NCC مارکروں کے لیے نیورل فولڈ سٹیننگ WT (تصویر 5E، G، I) اور Specc1l اتپریورتی (تصویر 5F، H، J) کے حصوں میں دیکھی گئی۔E9.5 پر، جب کہ NCC مارکروں نے WT حصوں (تصویر 5M, O, Q) میں ہجرت کرنے والے NCC کو داغ دیا تھا، Specc1l اتپریورتی ایمبریو (تصویر 5N, P, R) کے بے نقاب اعصابی تہوں میں بقایا NCC داغ دیکھے گئے تھے۔چونکہ SOX10 اور DLX2 CNCCs کی منتقلی کو نشان زد کرتے ہیں، اس نتیجہ سے پتہ چلتا ہے کہ SPECC1L کی کمی والے CNCCs نقل مکانی کے بعد کی تفصیلات حاصل کرتے ہیں لیکن اعصابی تہوں سے منتقل ہونے میں ناکام رہتے ہیں۔
سپیک 11 کی کمی عیب دار نیورل ٹیوب کی بندش، کرینیل نیورل کرسٹ سیلز اور اے جے کی ڈیلامینیشن کا باعث بنتی ہے۔
(A, B') E9.5 WT (A) جنین لے جانے والے کرینیل نیورل کریسٹ سیلز (CNCC) کو Wnt1-Cre (A' کے ساتھ لیبل لگا ہوا ہے۔اس کے برعکس، Speccc11 اتپریورتی ایمبریو کھلے نیورل فولڈز (B)، تیر کے نشان) اور CNCCs دکھاتے ہیں جو منتقل نہیں ہوئے (B'، تیر کے نشان)۔(C, D') برائٹ فیلڈ امیجز (C, D') اور امیونوسٹیننگ (C', D') CNCC مارکر DLX2 کے E10.5 WT ایمبریوز (C, C') اور Specc1l (D, D')۔WT E10.5 ایمبریو میں، DLX2-مثبت CNCC گل کے محراب (C'، تیر) کو نوآبادیاتی بناتا ہے، جبکہ اتپریورتیوں میں، کھلے اعصابی تہوں (D'، تیر) اور پہلے فارینجیل آرچز (D'، میں) نمایاں داغ برقرار رہتا ہے۔ تیر)۔) کچھ داغدار (تیر) کے ساتھ جو CNCC کی خراب ڈیلامینیشن اور ہجرت کی نشاندہی کرتے ہیں۔ER) مراحل E8.5 (E–L) اور E9.5 (M–R) پر WT اور Specc1l اتپریورتی جنین کے حصوں پر NCC مارکر SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H,) کے ساتھ لیبل لگایا گیا تھا۔ O, P) اور DLX2 (I, J, Q, R)E8.5 پر، جنگلی قسم کے نیورل فولڈ (NF) اور اتپریورتی حصوں میں NCC کے داغ دیکھے گئے۔E8.5 WT (K) اور اتپریورتی (L) میں SOX10 اور β-کیٹنین کے مشترکہ داغ سے اعصابی تہوں میں سیل کی حدود میں β-کیٹنین کے داغوں میں اضافہ ہوا ہے۔E9.5 پر، ہجرت کرنے والے CNCCs (M, O, Q) کے جنگلی قسم کے داغ دیکھے گئے، جبکہ اتپریورتیوں میں، غیر منظم شدہ CNCCs نے کھلے اعصابی تہوں (N, P, R) کو داغ دیا۔(S–Z) E9.5 اتپریورتن کے ساتھ WT اور Specc11DTM096/RRH048 ایمبریو کے کورونل حصوں میں Vivo AJ لیبلنگ تجزیہ۔ایک تخمینی سیکشنل ہوائی جہاز اوپری دائیں کونے میں دکھایا گیا ہے۔اتپریورتی ؤتکوں کے حصوں میں، F-actin (S, T) اور myosin IIb (U, V) کے داغوں میں اضافہ دیکھا گیا۔تصویر 3 میں وٹرو نتائج کی طرح، اتپریورتی ایمبریو میں، β-کیٹنین (W, X) اور E-cadherin (Y, Z) کے لیے جھلیوں کے داغوں میں اضافہ دیکھا گیا۔(AA-BB) apical-basal سیل کی سرحد سے باہر دیکھے جانے والے جنگلی قسم کے جنین کے ایک حصے کا ایک الیکٹران مائکروگراف چپکنے والے جنکشن (AA، تیر) کا ایک الگ الیکٹران گھنے خطہ دکھاتا ہے۔اس کے برعکس، Specc11 اتپریورتی ایمبریو (BB، تیر) کے حصوں میں، پورا apicobasal جنکشن الیکٹران کا گھنا ہے، جو کہ چپکنے والے جنکشن کی کثافت اور پھیلاؤ کی نشاندہی کرتا ہے۔
ہمارے مفروضے کو جانچنے کے لیے کہ تہہ بندی میں کمی تبدیل شدہ AJ کی وجہ سے ہے، ہم نے Specc1l اتپریورتی ایمبریو (تصویر 5S-Z) کے بے نقاب اعصابی تہوں میں AJ لیبلنگ کی جانچ کی۔ہم نے ایکٹین تناؤ کے ریشوں (تصویر 5S، T) میں اضافہ دیکھا اور ایکٹین ریشوں (تصویر 5U، V) پر مائیوسین IIB کے داغ کے ساتھ ساتھ بڑھتے ہوئے لوکلائزیشن کا مشاہدہ کیا۔اہم بات یہ ہے کہ ہم نے انٹر سیلولر حدود میں β-کیٹنین (تصویر 5W,X) اور E-cadherin (Fig. 5Y,Z) کے بڑھتے ہوئے داغوں کا مشاہدہ کیا۔ہم نے E8.5 ایمبریو (تصویر 5K، L) کے اعصابی تہوں میں این سی سی کے β-کیٹنین سٹیننگ کا بھی معائنہ کیا۔β-کیٹنین سٹیننگ Specc1l اتپریورتی نیورل فولڈز (تصویر 5L اور K) میں زیادہ مضبوط دکھائی دیتی ہے، یہ تجویز کرتی ہے کہ AJ تبدیلیاں شروع ہو چکی ہیں۔E9.5 ایمبریو کے کھوپڑی کے حصوں کے الیکٹران مائیکرو گرافس میں، ہم نے دوبارہ WT (تصویر 5AA، BB اور S1E-H) کے مقابلے Specc1l اتپریورتی ایمبریو میں پھیلے ہوئے الیکٹران کے گھنے داغ کا مشاہدہ کیا۔ایک ساتھ مل کر، یہ نتائج SPECC1L-kd U2OS خلیات میں ہمارے ان وٹرو نتائج کی حمایت کرتے ہیں اور تجویز کرتے ہیں کہ AJ کے غیر معمولی داغ ہمارے اتپریورتی ایمبریو میں CNCC کے استحکام سے پہلے ہیں۔
AKT سرگرمی اور E-cadherin استحکام کے درمیان معلوم مخالفانہ تعلقات کو دیکھتے ہوئے، 17,28 ہم نے PI3K-AKT سگنلنگ کی شمولیت کا قیاس کیا۔اس کے علاوہ، ہم نے اپنے کچھ اتپریورتی جنینوں میں ذیلی اپیڈرمل چھالوں کا مشاہدہ کیا جو E9.5-10.5 پر مہلک (<5%) سے بچ گئے اور اس کی بجائے E13.5 (تصویر S3) کے قریب آباد ہوئے۔Subepidermal vesicles PDGFRα12 کی بنیاد پر کم PI3K-AKT سگنلنگ کی پہچان ہیں۔Fantauzzo et al.(2014) نے اطلاع دی ہے کہ PdgfraPI3K/PI3K اتپریورتی ایمبریوز میں PDGFRα پر مبنی PI3K ایکٹیویشن میں خلل کے نتیجے میں subepidermal vesicles، neural tube defects، اور cleft palate phenotypes ہوتے ہیں۔درحقیقت، پین-AKT اور فعال فاسفوریلیٹڈ Ser473-AKT کی سطحوں کو Vivo میں Specc1l اتپریورتی ٹشوز میں E9.5 برانن گرفتاری (تصویر 6A-D) تک کم کر دیا گیا تھا۔فاسفوریلیٹڈ Ser473-AKT کی سطح میں کمی مکمل طور پر vivo (FIG. 6E) اور in vitro (FIG. 6F) میں پین-AKT کی سطح میں کمی کی وجہ سے ہو سکتی ہے۔وٹرو میں کمی صرف اس وقت دیکھی گئی جب U2OS خلیات سیل کی شکل اور AJ کثافت (شکل 6D) میں تبدیلیوں کے ساتھ مضبوطی سے ہم آہنگ تھے۔اس طرح، ہمارے اعداد و شمار سے پتہ چلتا ہے کہ SPECC1L کرینیو فیشل مورفوگنیسیس میں PI3K-AKT سگنلنگ کا ایک نیا مثبت ریگولیٹر ہے۔
(A–E) E8.5 (A,B) اور E9.5 (C,D) کھوپڑی کے حصے یا Specc1l اتپریورتی ایمبریوز (E) سے E9.5 lysates فعال فاسفوریلیٹڈ S473-AKT اور پین-AKT پروٹین کی کمی کی سطح کو ظاہر کرتے ہیں۔ ، کنٹرول ڈبلیو ٹی کے مقابلے میں۔ویسٹرن بلوٹنگ جنگلی قسم کے لائسیٹس اور اتپریورتی لائسیٹس پر انہی حالات میں کی گئی تھی۔SPECC1L کے لیے دکھائی گئی تصاویر ایک دھبے سے لی گئی تھیں۔اسی دھبے کو ہٹا دیا گیا اور اینٹی پین-ایکٹ اور β-ایکٹین اینٹی باڈیز کے ساتھ دوبارہ معائنہ کیا گیا۔E8.5 نیورل فولڈز (A, B) میں پین-AKT کی سطح اور E9.5 کھوپڑی کے حصوں میں فاسفوریلیٹڈ S473-AKT کی سطح نمایاں طور پر کم ہو گئی تھی۔(F) پین-AKT کی سطحیں اسی طرح SPECC1L-kd U2OS سیلز کے lysates میں کم ہوئیں جو اعلی سنگم پر کاٹے گئے تھے۔ایرر بارز تین آزاد مغربی بلاٹ کوانٹیفیکیشنز سے SEMs کی نمائندگی کرتے ہیں۔(GJ) E9.5 پر WT ایمبریو کے حصے بالترتیب KI67 اور کلیویڈ کیسپیس 3 سے داغے ہوئے ہیں، جو سیل کے پھیلاؤ (G, G') اور چھوٹی اپوپٹوٹک سرگرمی (H, H') کو ظاہر کرتے ہیں۔اسپیک 11 اتپریورتی جنین موازنہ سیل پھیلاؤ (I) دکھاتے ہیں ، لیکن اپوپٹوسس سے گزرنے والے خلیوں کی تعداد میں نمایاں اضافہ ہوا ہے (J)۔
اس کے بعد ہم نے پھیلاؤ اور اپوپٹوسس کے مارکروں کی جانچ کی۔ہم نے E9.5 ایمبریو (I کے مقابلے میں تصویر 6E، G) کے پھیلاؤ میں کوئی فرق نہیں دیکھا جس کا پھیلاؤ انڈیکس 82.5% WT mutants کے لیے اور 86.5% Specc1l mutants کے لیے جس کی پیمائش KI67 سٹیننگ (p <0.56، فشرز عین مطابق ٹیسٹ)۔اسی طرح، ہم نے E8.5 پر نیورل فولڈز میں کلیویڈ کیسپیس 3 کے داغ لگانے سے ماپا اپوپٹوسس میں کوئی فرق نہیں دیکھا جب تک کہ ایمبریو گرفتاری (نہیں دکھایا گیا) (نہیں دکھایا گیا)۔اس کے برعکس، تمام E9.5 اتپریورتی جنین (تصویر 6F، H اور J) میں اپوپٹوسس میں نمایاں اضافہ ہوا تھا۔اپوپٹوسس میں یہ مجموعی اضافہ PI3K-AKT سگنلنگ اور ابتدائی برانن مہلک 29,30,31 کے ساتھ مطابقت رکھتا ہے۔
اگلا، ہمارے kd خلیات میں AJ تبدیلیوں میں PI3K-AKT سگنلنگ کے لیے ایک کارگر کردار کی تصدیق کرنے کے لیے، ہم نے کیمیکل طور پر کنٹرول اور kd سیلز (شکل 7A-F) کے راستے کو تبدیل کیا۔ہم نے سنگم SPECC1L-kd خلیات میں مشاہدہ کردہ سیل کی شکل کی تبدیلی کے فینوٹائپ کو مارکر کے طور پر استعمال کیا، جسے ہم نے متعلقہ عمودی جہت (چوڑائی) کے سب سے طویل جہت (لمبائی) کے تناسب کا استعمال کرتے ہوئے مقدار درست کی۔نسبتاً گول یا کیوبائیڈل خلیات (شکل 7G) کے لیے 1 کا تناسب متوقع ہے۔سیل کی شکل کے علاوہ، ہم نے β-کیٹنین سٹیننگ (تصویر 7A'-F') کے ذریعے AJ پر اثر کی بھی تصدیق کی۔wortmannin کا ​​استعمال کرتے ہوئے PI3K-AKT راستے کی روک تھام کنٹرول سیل (شکل 7A, C) اور AJ (شکل 7A') میں سیل کی شکل کو تبدیل کرنے کے لئے کافی تھی۔PI3K-AKT ایکٹیویٹر SC-79 نے کنٹرول سیل میں سیل کی شکل (FIG. 7A, E) یا AJ توسیع (FIG. 7A') کو متاثر نہیں کیا۔SPECC1L-kd خلیوں میں، PI3K-AKT راستے کو مزید دبانے کے نتیجے میں apoptosis میں اضافہ ہوا (تصویر 7B,D) اور β-کیٹنین سٹیننگ (تصویر 7B') میں واضح اضافہ ہوا، جو کہ ہمارے ان ویوو ہیوی اتپریورتیوں کے ساتھ مطابقت رکھتا ہے۔اہم بات یہ ہے کہ PI3K-AKT پاتھ وے کو چالو کرنے سے سیل کی شکل (فگر 7B,F) اور AJ فینوٹائپس (شکل 7B") میں نمایاں بہتری آئی ہے۔سیل کی شکل میں تبدیلیوں کو سیل راؤنڈنس ریشو (سی سی آر) کے طور پر مقدار میں شمار کیا گیا تھا اور اس کا موازنہ اوپر بیان کیا گیا ہے (تصویر 7 جی)۔درحقیقت، کنٹرول سیلز (تصویر 7 جی، سی سی آر = 1.56) میں، ورٹمینن کا علاج سیل کی شکل کو نمایاں طور پر تبدیل کرنے کے لیے کافی تھا (تصویر 7 جی، سی سی آر = 3.61، پی <2.4 × 10-9) جس حد تک مشاہدہ کیا گیا تھا۔ SPECC1L میں۔-kd خلیات (تصویر 7G، CCR = 3.46)۔SPECC1L-kd خلیوں کا Wortmannin علاج (تصویر 7G، CCR = 3.60، نہ ہونے کے برابر) غیر علاج شدہ kd خلیات (تصویر 7G، CCR = 3.46، نہ ہونے کے برابر) یا wortmannin سے علاج شدہ کنٹرول سیل (تصویر 7G) سے زیادہ اہم نہیں تھا۔، CCR = 3.46، نہ ہونے کے برابر) اضافی طور پر سیل کی لمبائی کو متاثر کرتا ہے (7G، CCR = 3.61، نہ ہونے کے برابر)۔سب سے اہم بات یہ ہے کہ SC-79 AKT ایکٹیویٹر نے SPECC1L-kd خلیات (تصویر 7G، CCR = 1.74، p <6.2 × 10-12) کے لمبے فینوٹائپ کو بحال کیا۔یہ نتائج اس بات کی تصدیق کرتے ہیں کہ SPECC1L PI3K-AKT سگنلنگ کو منظم کرتا ہے اور تجویز کرتا ہے کہ SPECC1L میں اعتدال پسند کمی سیل کے آسنجن کو متاثر کرتی ہے، جبکہ مضبوط کمی اپوپٹوس (تصویر 8) کا باعث بنتی ہے۔
(A–F') کنٹرول (A, C, E) اور SPECC1L-kd (B, D, F) خلیات جن کا علاج PI3K-AKT پاتھ وے انحیبیٹر ورٹمینن (C, D) یا SC-79 ایکٹیویٹر (E, F) علاج کے ساتھ کیا جاتا ہے۔ .علاج نہ کیے جانے والے کنٹرول سیلز عام β-کیٹ سیلولر سٹیننگ (A') کے ساتھ کیوبائیڈل (A) ہوتے ہیں، جبکہ kd خلیے لمبے ہوتے ہیں (B) β-کیٹ سٹیننگ (B') کے ساتھ۔PI3K-AKT پاتھ وے کو دبانے کے بعد، β-cat کی توسیع (C') کے ساتھ کنٹرول سیل لمبے (C) ہو گئے، جبکہ kd خلیات اپوپٹوس (D) سے گزرنے لگے، جو ہمارے انتہائی تبدیل شدہ ایمبریوز کی طرح اور انتہائی بڑھا ہوا β-بلی دکھاتے ہیں۔داغ لگانا (D')۔PI3K-AKT پاتھ وے کو چالو کرنے کے بعد، کنٹرول سیلز کیوبائیڈل (E) رہے اور ان میں عام β-cat (E') داغ دھبے تھے، جبکہ kd خلیوں نے سیل کی شکل (F) اور β-cat (F') کے داغ کو نمایاں طور پر ظاہر کیا، جس سے ظاہر ہوتا ہے۔ (G) (AF) میں سیل کی شکل میں تبدیلی کی ڈگری کو MetaMorph سافٹ ویئر کا استعمال کرتے ہوئے سب سے لمبے جہت (لمبائی) کے سیل راؤنڈنس ریشو (CCR) اور متعلقہ عمودی جہت (چوڑائی) کا استعمال کرتے ہوئے مقدار درست کی گئی۔غیر علاج شدہ (NT) SPECC1L-kd خلیات (CCR = 3.46) کنٹرول سیل (CCR = 1.56، p <6.1 × 10–13) سے نمایاں طور پر لمبے تھے۔کنٹرول خلیوں میں PI3K-AKT کے راستے کی روک تھام سیل کی شکل میں اسی طرح کی لمبائی کا سبب بننے کے لئے کافی تھی (CCR = 3.61، p <2.4×10-9)۔اسی طرح، SPECC1L-kd خلیوں میں SC-79 کے ذریعے AKT ایکٹیویشن نے سیل کی لمبائی کو کنٹرول کی سطح پر بحال کیا (CCR = 1.74، p <6.2 × 10–12)۔SPECC1L-kd خلیوں کے Wortmannin کے علاج کے نتیجے میں apoptosis میں اضافہ ہوا لیکن علاج نہ کیے جانے والے kd (CCR=3.46, ns) یا wortmannin سے علاج شدہ کنٹرول سیلز (3.61) کے مقابلے میں سیل کی شکل میں تبدیلی (CCR=3.60) میں مزید اضافہ نہیں ہوا۔ns = کوئی فرق نہیں پڑتا۔+/- 50 خلیات کے لیے SEM پیمائش دکھائی گئی ہے۔شماریاتی اختلافات کا شمار طالب علم کے ٹی ٹیسٹ کے ذریعے کیا گیا۔
(A) PI3K-AKT راستے کی روک تھام اور چالو کرنے کی منصوبہ بندی کی نمائندگی جس کے نتیجے میں بالترتیب AJ میں تبدیلیاں اور بچاؤ ہوتا ہے۔(B) SPECC1L کے ذریعہ AKT پروٹین اسٹیبلائزیشن کے لیے مجوزہ ماڈل۔
پریمیگریٹری CNCCs کو AJ lysis کی ضرورت ہوتی ہے تاکہ anterior neural fold neuroepithelial خلیات 1,15,32 سے الگ ہوں۔AJ اجزاء کا بڑھتا ہوا داغ اور SPECC1L کی کمی والے خلیوں میں apical-basal AJ کی غیر متناسب تقسیم کا نقصان دونوں وٹرو اور vivo میں، SPECC1L کی β-catein سے جسمانی قربت کے ساتھ مل کر، تجویز کرتا ہے کہ AJ مقامی استحکام کو مناسب طریقے سے برقرار رکھنے کے لیے SPECC1L کام کرتا ہے۔ تنظیم کے پٹھوں.ایکٹین سائٹوسکلٹن۔ایکٹین سائٹوسکلٹن اور β-کیٹنین کے ساتھ SPECC1L کا وابستگی اور SPECC1L کی عدم موجودگی میں کنڈینسڈ ایکٹین فلیمینٹس کی تعداد میں اضافہ AJ کثافت میں مشاہدہ شدہ اضافے کے مطابق ہے۔ایک اور امکان یہ ہے کہ SPECC1L کی کمی والے خلیوں میں ایکٹین ریشوں کی بڑھتی ہوئی تعداد انٹر سیلولر تناؤ میں تبدیلی کا باعث بنتی ہے۔چونکہ سیلولر تناؤ AJ 33 کی حرکیات کو متاثر کرتا ہے، وولٹیج کی تبدیلیوں کے نتیجے میں AJ 34 زیادہ پھیل سکتا ہے۔لہذا کوئی بھی تبدیلی CNCC کی تہوں کو متاثر کرے گی۔
Wnt1 کا اظہار ابتدائی عصبی تہوں میں ہوتا ہے جو عصبی کرسٹ خلیوں کو جنم دیتے ہیں۔اس طرح، Wnt1-cre نسب کا سراغ لگانا NCC35 سے پہلے اور منتقلی دونوں کو نشان زد کرتا ہے۔تاہم، Wnt1 ابتدائی نیورل فولڈز 35,36 سے اخذ کردہ ڈورسل برین ٹشو کلون کو بھی نشان زد کرتا ہے، جس سے یہ امکان ہوتا ہے کہ کھلے نیورل فولڈز میں Wnt1 مارکر کے لیے E9.5 اتپریورتیوں کا ہمارے داغ CNCC نہیں ہے۔NCC مارکر AP2A اور SOX10 کے لیے ہمارے مثبت داغ نے اس بات کی تصدیق کی کہ Specc11 اتپریورتی جنین کے بے نقاب اعصابی تہوں میں واقعتا CNCC موجود تھا۔اس کے علاوہ، چونکہ AP2A اور SOX10 ابتدائی منتقلی NCC کے مارکر ہیں، مثبت داغ نے اشارہ کیا کہ یہ خلیات نقل مکانی کے بعد کے CNCC ہیں جن کو E9.5 کے ذریعے درجہ بندی نہیں کیا جا سکتا۔
ہمارے اعداد و شمار سے پتہ چلتا ہے کہ SPECC1L کے ذریعہ AJ کا سالماتی ضابطہ PI3K-AKT سگنلنگ کے ذریعہ ثالثی کیا جاتا ہے۔SPECC1L کی کمی والے خلیوں اور بافتوں میں AKT سگنلنگ کم ہو جاتی ہے۔Fantauzzo et al کی طرف سے نتائج.craniofacial morphogenesis میں PI3K-AKT سگنلنگ کے لیے براہ راست کردار کی حمایت کرتا ہے۔(2014) نے دکھایا کہ PDGFRα پر مبنی PI3K-AKT سگنلنگ کو چالو کرنے کی کمی ایک درار تالو فینوٹائپ کا باعث بنتی ہے۔ہم یہ بھی ظاہر کرتے ہیں کہ PI3K-AKT راستے کی روک تھام U2OS خلیوں میں AJ اور سیل کی شکل کو تبدیل کرنے کے لئے کافی ہے۔ہمارے نتائج کے مطابق، Cain et al.37 نے ظاہر کیا کہ اینڈوتھیلیل خلیوں میں PI3K α110 سبونائٹ کی کمی کے نتیجے میں پیری سیلولر β-کیٹنین سٹیننگ میں اسی طرح کا اضافہ ہوتا ہے، جسے "کنیکٹیویٹی انڈیکس" میں اضافہ کہا جاتا ہے۔تاہم، اینڈوتھیلیل سیلز میں جن کے ایکٹین فلیمینٹس پہلے ہی انتہائی منظم ہیں، PI3K-AKT پاتھ وے کو دبانے کے نتیجے میں سیل کی شکل ڈھیلی ہو جاتی ہے۔اس کے برعکس، SPECC1L-kd U2OS خلیوں نے ایک لمبا سیل شکل دکھایا۔یہ فرق سیل کی قسم مخصوص ہو سکتا ہے۔جبکہ PI3K-AKT سگنلنگ کو دبانا ایکٹین سائٹوسکلٹن کو مستقل طور پر متاثر کرتا ہے، سیل کی شکل پر اثر کا تعین سنٹرل ایکٹین ریشوں کی کثافت اور تنظیم میں تبدیلیوں کی وجہ سے تناؤ میں ہونے والی تبدیلیوں سے ہوتا ہے۔U2OS سیلز میں، ہم نے SPECC1L کی کمی AJ تبدیلی اور بحالی کے مارکر کے طور پر صرف سیل کی شکل کی تبدیلیوں کا استعمال کیا۔آخر میں، ہم یہ قیاس کرتے ہیں کہ SPECC1L کی کمی میں AKT راستے کی روک تھام AJ استحکام کو بڑھاتی ہے اور CNCC میں delamination کو کم کرتی ہے۔
دلچسپ بات یہ ہے کہ SPECC1L کی غیر موجودگی میں فاسفوریلیٹڈ 473-AKT لیولز کے علاوہ وٹرو اور ویوو میں پین-AKT کی سطحیں کم ہوئیں، AKT پروٹین کے استحکام یا ٹرن اوور کی سطح پر PI3K-AKT سگنلنگ کے ضابطے کی تجویز کرتی ہے۔SPECC1L اور MID1 جین، دونوں Opitz/GBBB سنڈروم سے وابستہ ہیں، ایسے پروٹین کو انکوڈ کرتے ہیں جو مائیکرو ٹیوبلز 18,22 کو مستحکم کرتے ہیں۔وہ طریقہ کار جس کے ذریعے SPECC1L اور MID1 مائیکرو ٹیوبول اسٹیبلائزیشن میں ثالثی کرتے ہیں۔ایس پی ای سی سی 1 ایل کے معاملے میں، اس استحکام میں مائیکرو ٹیوبلس 18 کے ذیلی سیٹ کا بہتر ایسٹیلیشن شامل ہے۔یہ ممکن ہے کہ SPECC1L دوسرے پروٹین جیسے AKT کو مستحکم کرنے کے لیے اسی طرح کا طریقہ کار استعمال کرے۔یہ دکھایا گیا ہے کہ AKT پروٹین میں لائسین کی باقیات کا ایسٹیلیشن جھلی کی لوکلائزیشن اور فاسفوریلیشن میں کمی کا باعث بنتا ہے۔اس کے علاوہ، AKT پر ایک ہی لائسین کی باقیات پر K63 چین کی ہر جگہ اس کی جھلی کی لوکلائزیشن اور ایکٹیویشن 39,40 کے لیے ضروری ہے۔SPECC1L پروٹین کے ساتھ تعامل کرنے والے کئی عوامل میں سے مختلف ہائی تھرو پٹ یسٹ دو ہائبرڈ اسکرینوں میں شناخت کی گئی ہے، چار - CCDC841، ECM2942، APC اور UBE2I43 - پروٹین ٹرن اوور یا استحکام میں ubiquitination یا sumoylation کے ذریعے ملوث ہیں۔SPECC1L AKT lysine کی باقیات کی ترجمہ کے بعد کی ترمیم میں ملوث ہو سکتا ہے، AKT کے استحکام کو متاثر کرتا ہے۔تاہم، AKT پروٹین کی لوکلائزیشن اور استحکام میں SPECC1L کے اہم کردار کو واضح کرنا باقی ہے۔
Vivo میں SPECC1L اظہار میں شدید نقائص کے نتیجے میں AJ مارکر کے داغدار اور عیب دار CNCC اوورلے کے ساتھ ساتھ apoptosis اور ابتدائی برانن کی مہلکیت میں اضافہ ہوا۔پچھلی رپورٹس سے پتہ چلتا ہے کہ اپوپٹوسس کی بڑھتی ہوئی سطح کے ساتھ ماؤس اتپریورتیوں کا تعلق نیورل ٹیوب کے نقائص 44,45,46,47 اور کرینیو فیشل نقائص 48 سے ہے۔یہ تجویز کیا گیا ہے کہ عصبی تہوں یا فارینجیل آرچز میں خلیوں کی ضرورت سے زیادہ موت کے نتیجے میں مناسب مورفوجینیٹک حرکت 48,49,50 کے لیے ضروری خلیوں کی ناکافی تعداد ہو سکتی ہے۔اس کے برعکس، ہماری SPECC1L کی کمی والی سیل لائنیں معتدل طور پر کم SPECC1L اظہار کے ساتھ سیل کی موت میں اضافے کے ثبوت کے بغیر صرف AJ تبدیلیاں دکھاتی ہیں۔تاہم، ان Kd خلیوں میں PI3K-AKT راستے کی کیمیائی روک تھام کے نتیجے میں apoptosis میں اضافہ ہوا۔اس طرح، SPECC1L اظہار یا فنکشن میں معمولی کمی سیل کی بقا کو یقینی بناتی ہے۔یہ اس مشاہدے سے مطابقت رکھتا ہے کہ نایاب Specc11 اتپریورتی جنین جو سینٹ میں گرفتاری سے بچ جاتے ہیں۔E9.5—شاید جین کی گرفت میں کمی کی وجہ سے—اپنی نیورل ٹیوبیں بند کرنے اور بعد میں نشوونما کو روکنے کے قابل ہوتے ہیں، اکثر کرینیو فیشل نقائص (تصویر S3) کے ساتھ۔اس کے ساتھ ہم آہنگ ہیٹروزائگس اسپیک 1 ایل ایمبریوز کا نایاب واقعہ ہے جس میں کرینیو فیشل اسامانیتا ہے - شاید جین کیپچر کی کارکردگی میں اضافہ کی وجہ سے - نیز زیبرا فش میں پایا جانا جس میں دو SPECC1L آرتھولوگس (specc1lb) میں سے ایک ایمبریوز کا سبب بنتا ہے۔ نچلے جبڑے اور دو طرفہ درار51۔اس طرح، انسانی مریضوں میں شناخت شدہ heterozygous SPECC1L فنکشن کے نقصان کے تغیرات کرینیو فیشل مورفوجینیسیس کے دوران SPECC1L فنکشن میں چھوٹی خرابیوں کا سبب بن سکتے ہیں، جو ان کے orofacial clefts کی وضاحت کے لیے کافی ہیں۔انٹر سیلولر رابطوں کا SPECC1L پر مبنی ضابطہ بھی palatogenesis اور pharyngeal arches کے فیوژن میں کردار ادا کر سکتا ہے۔SPECC1L فنکشن کے مزید مطالعے سے نیوروپیٹیلیل سیل موٹیلٹی اور کرینیو فیشل مورفوجینیسیس میں نیورل ٹیوب بند ہونے کے دوران CNCC میں عارضی انٹر سیلولر رابطوں کے کردار کو واضح کرنے میں مدد ملے گی۔
U2OS osteosarcoma کنٹرول اور SPECC1L-kd خلیات پہلے بیان کیے جا چکے ہیں (سعدی ایٹ ال۔، 2011)۔ایس پی ای سی سی 1 ایل کے خلاف اینٹی باڈیز کی خصوصیات پہلے بھی کی گئی ہیں (سعدی ایٹ ال۔، 2011)۔اینٹی β-کیٹنین اینٹی باڈیز (خرگوش؛ 1:1000؛ سانتا کروز، ڈلاس، TX) (ماؤس؛ 1:1000؛ سیل سگنلنگ ٹیکنالوجی، ڈینورس، MA)، myosin IIb (1:1000؛ سگما-الڈرچ، سینٹ لوئس) ) , MO) ), E-cadherin (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego , California), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), phospho-Ser473-AKT (1:1000; سیل سگنلنگ ٹیکنالوجی, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA )، KI67 (1:1000؛ سیل سگنلنگ ٹیکنالوجی، ڈینورس، ایم اے)، کلیویڈ کیسپیس 3 (1:1000؛ سیل سگنلنگ ٹیکنالوجی، ڈینورس، ایم اے) اور β-ایکٹن (1:2500؛ سگما-الڈرچ، سینٹ لوئس، جیسا کہ بیان کیا گیا ہے MO ) استعمال کیا گیا تھا۔.ایکٹین فلیمینٹس کو ایکٹی اسٹین روڈامائن فیلوڈین (سائٹوسکیلیٹن، ڈینور، کولوراڈو) سے داغ دیا گیا تھا۔
U2OS کنٹرول سیلز اور SPECC1L-kd سیلز کو معیاری ہائی گلوکوز DMEM میں 10% فیٹل بوائن سیرم (لائف ٹیکنالوجیز، کارلسباد، CA) کے ساتھ مکمل کیا گیا تھا۔AJ تبدیلیوں کے لیے، 2 x 105 خلیات کو شیشے پر 0.1% پورسائن جیلیٹن (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) کے ساتھ علاج کیا گیا اور سیل کی شکل میں تبدیلیوں کے لیے مشاہدہ کیا گیا۔خلیات کو مختلف اشارے شدہ وقت کے پوائنٹس پر جمع کیا گیا تھا: بوائی کے 4 گھنٹے بعد (t = 1)، بیج بونے کے 24 گھنٹے بعد (t = 2)، سیل کی شکل میں تبدیلی کے بغیر سنگم (t = 3)، سیل کی شکل میں تبدیلی (t = 4) ، سیل کی شکل میں تبدیلی کے بعد 24 گھنٹے (t = 5) اور سیل کی شکل میں تبدیلی کے بعد 48 گھنٹے (t = 6) (تصویر 1, 2, 3)۔PI3K-AKT پاتھ وے کو ماڈیول کرنے کے لیے، خلیات کو PI3K-AKT inhibitor wortmannin (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) یا SC-79 ایکٹیویٹر (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota Adams) کے ساتھ اشارہ شدہ ارتکاز پر کلچر کیا گیا تھا۔کیمیکلز پر مشتمل میڈیم روزانہ تبدیل کیا جاتا تھا۔
عام کلچر کے حالات میں لائیو کنٹرول اور KD سیلز پر فریم بہ فریم ریکارڈنگ کی گئی تھی، اور فیز کنٹراسٹ امیجز ہر 10 منٹ میں 7 دنوں کے لیے اکٹھی کی جاتی تھیں۔کمپیوٹر کے زیر کنٹرول لائیکا ڈی ایم آئی آر بی الٹی مائکروسکوپ کا استعمال کرتے ہوئے تصاویر حاصل کی گئیں جو میکینیکل اسٹیج سے لیس تھیں اور QImaging Retiga-SRV کیمرے سے منسلک 10 × N-PLAN مقصد۔امیجنگ کے دوران، سیل کلچرز کو 5% CO2 کے ساتھ مرطوب ماحول میں 37 ° C پر برقرار رکھا گیا۔
ریجنل اتپریورتی ماؤس ریسورس سینٹر (UC Davis, CA) سے دو جین ٹریپ ES سیل لائنز DTM096 اور RRH048 کو سپیک 11 کی کمی والی ماؤس لائنیں بنانے کے لیے استعمال کیا گیا تھا، نامزد کردہ Specc1lgtDTM096 اور Specc1lgtRRH046۔مختصراً، 129/REJ ES خلیوں کو C57BL6 بلاسٹوسٹس میں انجکشن لگایا گیا تھا۔نتیجے میں chimeric نر چوہوں کو مادہ C57BL6 چوہوں کے ساتھ افزائش کی گئی تاکہ اگوٹی کوٹ کی رنگت والی اولاد کی شناخت کی جا سکے۔جین ٹریپ ویکٹر انسرٹس کی موجودگی ہیٹروزائگوٹس کی شناخت کے لیے استعمال کی گئی تھی۔چوہوں کو 129/REJ؛ C57BL6 کے مخلوط پس منظر پر رکھا گیا تھا۔جینیاتی ٹریپ ویکٹر کے داخل کرنے کی جگہ کے مقام کی تصدیق RT-PCR، جینوم کی ترتیب، اور جینیاتی تکمیل (ضمنی شکل 1) سے ہوئی۔ڈبل heterozygous Specc1lGT چوہوں کے CNCC نسب کا پتہ لگانے کے لیے، ROSAmTmG (#007576) اور Wnt1-Cre (#003829) چوہوں (جیکسن لیبارٹری، بار ہاربر، ME) کو آر او ایس ایم ٹی ایم جی اور ڈبلیو این ٹی 1-سی سی سی سی سی ایل ٹی ایم سی سی سی ایل 1 میں پیدا کرنے کے لیے عبور کیا گیا۔چوہوں میں تمام تجربات یونیورسٹی آف کنساس میڈیکل سینٹر کی ادارہ جاتی جانوروں کی دیکھ بھال اور استعمال کمیٹی کے منظور شدہ پروٹوکول کے مطابق کیے گئے۔
جنین کو کمرے کے درجہ حرارت پر 60 منٹ کے لیے (1% formaldehyde، 0.2% glutaraldehyde، 2 mM MgCl2، 0.02% NP-40، 5 mM EGTA) میں طے کیا گیا تھا۔ایکس گیل سٹیننگ سلوشن میں فکسیشن کے بعد (5 ایم ایم پوٹاشیم فیریکیانائیڈ، 5 ایم ایم پوٹاشیم فیروکیانائیڈ، 2 ایم ایم ایم جی سی ایل 2، 0.01٪ سوڈیم ڈوکسائیکولیٹ، 0.02٪ این پی-40، 1 ملی گرام/ملی لیٹر ایکس گیل) داغ کی نشوونما 3 °C پر کی گئی۔ .1-6 گھنٹے کے اندر °C۔ایمبریوز کو 4٪ PFA میں پوسٹ فکس کیا گیا تھا اور تصور کیا گیا تھا۔
ویسٹرن بلوٹنگ کے لیے، خلیات کو غیر فعال لیسیز بفر (پرومیگا، فِچبرگ، WI) میں HALT پروٹیز انحیبیٹرز (Sigma-Aldrich، St. Louis, MO) کے مرکب کے ساتھ ملایا گیا تھا۔لائسیٹس کو 12٪ پولی کریلامائڈ منی پروٹین ٹی جی ایکس ریڈی میڈ جیل (بائیو ریڈ، ہرکیولس، سی اے) پر پروسیس کیا گیا اور اموبیلون پی وی ڈی ایف جھلیوں (ای ایم ڈی ملی پور، بلریکا، ایم اے) میں منتقل کیا گیا۔جھلیوں کو پی بی ایس میں 5٪ دودھ میں بلاک کیا گیا تھا جس میں 0.1٪ ٹوین تھا۔اینٹی باڈیز کو راتوں رات 4 ° C پر یا کمرے کے درجہ حرارت پر ایک گھنٹے کے لیے انکیوبیٹ کیا جاتا تھا۔Femto SuperSignal West ECL reagent (Thermo Scientific, Waltham, MA) سگنل جنریشن کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔امیونوسٹیننگ کے لیے، ایمبریوز کو راتوں رات 4٪ PFA/PBS میں طے کیا گیا اور کریوپریزر کیا گیا۔پی بی ایس میں ٹشو کرائی سیکشن بلاک کیے گئے تھے جن میں 1% نارمل گوٹ سیرم (تھرمو سائنٹیفک، والتھم، ایم اے) اور 0.1% ٹرائٹن X-100 (سگما-الڈرچ، سینٹ لوئس، ایم او) تھا اور پھر انکیوبیٹر میں 4°C پر انکیوبیٹر رات.اینٹی اینٹی باڈی اور فلوروسینٹ سیکنڈری اینٹی باڈی (1:1000) کے ساتھ 4°C پر 1 گھنٹے کے لیے۔داغ والے حصے پرو لانگ گولڈ میڈیم (تھرمو سائنٹیفک، والتھم ایم اے) میں رکھے گئے تھے اور لائیکا ٹی سی ایس ایس پی ای کنفوکل مائکروسکوپ کا استعمال کرتے ہوئے فلیٹ امیجز حاصل کی گئیں۔ہر امیونوسٹیننگ کم از کم دو اتپریورتی جنینوں کے سرسیکشن پر تین آزاد تجربوں کے طور پر کی گئی تھی۔ایک نمائندہ تجربہ دکھایا گیا ہے۔
خلیوں کو ترمیم شدہ RIPA بفر (20 mM Tris-HCl، pH 8.0، 1% NP-40، 130 mM NaCl، 10% گلیسرول، 2 mM EDTA، اور HALT پروٹیز روکنے والا (Sigma-Aldrich، MOUI)) میں انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ مختصراً، lysates کو پروٹین G مقناطیسی موتیوں (Life Technologies, Carlsbad, CA) کے ساتھ پہلے سے پاک کیا گیا اور پھر 4° C پر راتوں رات انکیوبیٹ کیا گیا۔ اینٹی SPECC1L یا IgG پروٹین G پروٹین موتیوں کے ساتھ SPECC1L نکالنے کے لیے استعمال کیا گیا اور ویسٹرن بلوٹنگ اینٹی ایس پی ای سی سی 1 ایل کے ذریعے کی گئی۔ اوپر بیان کردہ -β-کیٹنین اینٹی باڈی دکھائے گئے شریک IP تجربات چار آزاد تجربات کے نمائندے ہیں۔
یونیورسٹی آف کنساس میڈیکل سینٹر کے الیکٹران مائکروسکوپی سینٹر کو فکسڈ کلچرڈ سیل یا ماؤس ایمبریونک ٹشوز فراہم کیے گئے۔مختصراً، نمونوں کو EMbed 812 رال (الیکٹران مائیکروسکوپی سائنسز، فورٹ واشنگٹن، PA) میں سرایت کیا گیا، راتوں رات 60°C پر پولیمرائز کیا گیا، اور ہیرے کے بلیڈ سے لیس Leica UC7 الٹرا مائیکروٹوم کا استعمال کرتے ہوئے 80 nm پر سیکشن کیا گیا۔حصوں کو JEOL JEM-1400 ٹرانسمیشن الیکٹران مائکروسکوپ کا استعمال کرتے ہوئے 100 kV Lab6 گن سے لیس کیا گیا تھا۔
اس مضمون کا حوالہ کیسے دیا جائے: ولسن، این آر وغیرہ۔SPECC1L کی کمی کٹے ہوئے جوڑوں کے استحکام میں اضافہ اور کرینیل نیورل کرسٹ سیلز کی ڈیلامینیشن کو کم کرنے کا باعث بنتی ہے۔سائنس.6، 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016)۔
سینٹ جین، جے پی۔عصبی کرسٹ کی شمولیت اور تفریق۔(اسپرنگر سائنس + بزنس میڈیا؛ لینڈز بایو سائنس/یوریکا ڈاٹ کام، 2006)۔
Cordero، DR et al.کرینیئل نیورل کرسٹ سیلز حرکت میں ہیں: کرینیو فیشل ڈویلپمنٹ میں ان کا کردار۔امریکی جرنل آف میڈیکل جینیٹکس۔حصہ A 155A، 270–279، doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011)۔
بولانڈ، آر پی نیورو کرسٹوپیتھیا: اس کی ترقی اور ترقی 20 سالوں میں۔ماہر اطفال۔پیتھالوجیلیبارٹریدوائی.17، 1–25 (1997)۔
مینگولڈ ای.، لڈوگ کے یو اور نوٹن ایم ایم بریک تھرو ان دی جینیٹکس آف اوروفیشل کلیفٹس۔مالیکیولر میڈیسن 17، 725–733، doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011) میں رجحانات۔
مینو، ایم اور ریلی، ایف ایم مالیکیولر میکانزم آف کرینیئل نیورل کریسٹ سیل ہجرت اور کرینیو فیشل ڈویلپمنٹ کے دوران پیٹرننگ۔ترقی 137، 2605–2621، doi: 10.1242/dev.040048 (2010)۔
ڈکسن، ایم جے، میرازیٹا، ایم ایل، بیٹی، ٹی ایچ اور مرے، جے کے کلیفٹ ہونٹ اینڈ پلیٹ: جینیاتی اور ماحولیاتی اثرات کو سمجھنا۔قدرتی تبصرہ.جینیات 12، 167–178، doi: 10.1038/nrg2933 (2011)۔
انگرام، سی آر وغیرہ۔انٹرفیرون ریگولیٹنگ فیکٹر 6 (Irf6) کی کمی والے چوہوں میں جلد، اعضاء، اور کرینیو فیشل ریجن کی غیر معمولی مورفوگنیسیس۔نیشنل جینیٹ۔38، 1335–1340، doi: 10.1038/ng1903 (2006)۔
Peyrard-Janvid، M. et al.GRHL3 میں غالب تغیرات وان ڈیر واورڈ سنڈروم کا سبب بنتے ہیں اور زبانی پیریڈرم کی نشوونما کو روکتے ہیں۔Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014)۔
ہیرس، ایم جے اور جوریلوف، ڈی ایم نیورل ٹیوب کی بندش میں نقائص کے ساتھ ماؤس اتپریورتیوں کی فہرست کو اپ ڈیٹ کریں اور نیورل ٹیوب کی بندش کی مکمل جینیاتی تفہیم کی طرف پیش رفت کریں۔پیدائشی نقائص کی تحقیقات۔حصہ A، کلینیکل اینڈ مالیکیولر ٹیریٹولوجی 88، 653–669، doi: 10.1002/bdra.20676 (2010)۔
Fantauzzo, KA & Soriano, P. PI3K- ثالثی PDGFRalpha سگنلنگ p53 پر منحصر انٹرا سیلولر راستے کے ذریعے کنکال کی نشوونما میں بقا اور پھیلاؤ کو منظم کرتا ہے۔جین ڈیولپمنٹ 28، 1005–1017، doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014)۔
کوپ، اے جے، گرین، این ڈی اور مرڈوک، جے این ڈیشیولڈ: نیورل ٹیوب کی بندش سے متضاد توسیع کا تعلق۔نیورولوجی میں رجحانات۔26، 453–455، doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003)۔