347 سٹینلیس سٹیل کوائلڈ نلیاں کیمیکل جزو ,کراس سے منسلک ماس سپیکٹرو میٹری (CLMS) کا استعمال کرتے ہوئے ناول انٹرفیرون-ریسپانسیو ہیومن لیوکوائٹ اینٹیجن-A (HLA-A) چیپیرون پروٹین کی شناخت

Nature.com پر جانے کا شکریہ۔آپ محدود سی ایس ایس سپورٹ کے ساتھ براؤزر کا ورژن استعمال کر رہے ہیں۔بہترین تجربے کے لیے، ہم تجویز کرتے ہیں کہ آپ ایک اپ ڈیٹ شدہ براؤزر استعمال کریں (یا انٹرنیٹ ایکسپلورر میں مطابقت موڈ کو غیر فعال کریں)۔اس کے علاوہ، جاری تعاون کو یقینی بنانے کے لیے، ہم سائٹ کو بغیر اسٹائل اور جاوا اسکرپٹ کے دکھاتے ہیں۔
سلائیڈرز فی سلائیڈ تین مضامین دکھا رہے ہیں۔سلائیڈوں کے ذریعے جانے کے لیے پیچھے اور اگلے بٹنوں کا استعمال کریں، یا ہر سلائیڈ سے گزرنے کے لیے آخر میں سلائیڈ کنٹرولر بٹن استعمال کریں۔

مصنوعات کی وضاحت

سٹینلیس سٹیل 347L کوائل ٹیوبیں، سٹیل گریڈ: SS347L

انٹرفیرون سگنلنگ سسٹم ماحول سے پیتھوجینک اور اندرونی پیتھولوجیکل سگنلز کی وسیع رینج کے لیے ایک مضبوط سائٹوکائن ردعمل پیدا کرتا ہے، جس کے نتیجے میں انٹرفیرون-انڈیکیبل پروٹین کے ذیلی سیٹ شامل ہوتے ہیں۔ہم نے انٹرفیرون سے متاثرہ پروٹین کے ڈومین میں پروٹین-پروٹین کے نئے تعاملات کا پتہ لگانے کے لیے DSS-ثالثی کراس-لنک ماس اسپیکٹومیٹری (CLMS) کا اطلاق کیا۔متوقع انٹرفیرون-انڈیکیبل پروٹین کے علاوہ، ہم نے کینونیکل انٹرفیرون-انڈیکیبل پروٹین جیسے MX1، USP18، OAS3، اور STAT1 کے ناول انٹرمولیکولر اور انٹرمولیکولر کراس لنکڈ ایڈکٹس کی بھی نشاندہی کی۔ہم نے HLA-A پروٹینز (H2BFS-HLA-A-HMGA1) کے ذریعے بنائے گئے انٹرفیرون-انڈیکیبل پروٹین نیٹ ورکس کے ایک ناول سیٹ کی آرتھوگونل توثیق پر توجہ مرکوز کی جس میں شریک مدافعتی عمل کا استعمال کرتے ہوئے اور مالیکیولر ڈائنامکس ماڈلنگ کا استعمال کرتے ہوئے ان کے مزید مطالعے پر توجہ دی گئی۔پروٹین کمپلیکس کی تعمیری حرکیات کی ماڈلنگ نے متعدد تعامل سائٹس کا انکشاف کیا جو CLMS کے نتائج میں شناخت شدہ تعاملات کی عکاسی کرتی ہیں۔ایک ساتھ، ہم انٹرفیرون کے ذریعے نئے سگنلنگ کمپلیکس کی نشاندہی کرنے کے لیے CLMS کا ایک پائلٹ مطالعہ پیش کرتے ہیں، اور ٹیومر مائیکرو ماحولیات میں پروٹین کے تعاملات کی نئی حرکیات کی شناخت کے لیے CLMS کے وسیع استعمال کے منتظر ہیں۔
انکولی مدافعتی ردعمل شروع ہونے سے پہلے، میزبان کا فطری دفاعی نظام ایک جراثیم کش ردعمل کو ماؤنٹ کرتا ہے جس میں خفیہ الفا ہیلیکل سائٹوکائنز کے خاندان کے ذریعے مداخلت کی جاتی ہے جسے انٹرفیرون (IFNs) کہتے ہیں۔قسم I IFN کلاسز IFNα اور IFNβ سیلولر ردعمل کو چالو کرتی ہیں، بشمول اینٹی وائرل، پروپوپٹوٹک، پروینفلامیٹری، اور اینٹی پرولیفیریٹو سٹیٹس۔انسانوں میں، IFNα کی 13 ذیلی قسمیں معلوم ہیں، سبھی کروموسوم 91 پر کلسٹرڈ ہیں۔ حیرت کی بات یہ ہے کہ طبی استعمال کے لیے صرف IFNα2 کا مطالعہ کیا گیا ہے۔حال ہی میں، IFNα کی دیگر ذیلی اقسام پر تحقیق پر خصوصی توجہ دی گئی ہے۔ایک حالیہ مطالعہ سے پتہ چلتا ہے کہ IFNα14 کینونیکل IFNα2 ذیلی قسم کے مقابلے میں HBV2 اور HIV-13,4 نقل کو محدود کرنے میں سب سے زیادہ مؤثر isoforms میں سے ایک ہے۔
یہ قائم کیا گیا ہے کہ متحرک قسم I انٹرفیرون ریسیپٹر کمپلیکس (IFNAR1 اور IFNAR2) جینس کنیزس TYK2 اور JAK15,6 کے ذریعہ ثالثی کی جانے والی سگنل کی منتقلی کاسکیڈ کو متحرک کرتے ہیں۔یہ جینس کناسز فاسفوریلیٹ سگنل ٹرانسڈیوسرز اور ٹرانسکرپشنل پروٹین ایکٹیویٹرز (STAT1 اور STAT2) کو ٹائروسین کی باقیات پر SH2 ڈومین کی ثالثی heterodimerization6 کو شروع کرتے ہیں۔اس کے بعد، IRF9 STAT heterodimers کو IFN-stimulated factor 3 جین (ISGF3) کا ایک trimeric کمپلیکس بنانے کے لیے باندھتا ہے، جو نیوکلئس میں منتقل ہوتا ہے اور 2000 سے زیادہ انٹرفیرون-حوصلہ افزائی جینز (ISGs) 5,6,7، کی نقل کو اکساتا ہے۔
ISGs پیدائشی مدافعتی نظام کی ریڑھ کی ہڈی بناتے ہیں، خاص طور پر وائرل حملے کے جواب میں۔وائرل انفیکشن کے خلاف دفاع کی پہلی لائن کے طور پر، خلیات تیزی سے سیلولر پروٹین کے وسیع تعاملات کو حیاتیاتی سرگرمیوں کی ایک وسیع رینج کے ساتھ تعینات کرتے ہیں۔ان پروٹینوں میں پیٹرن ریکگنیشن ریسیپٹرز، سگنلنگ مالیکیولز، ٹرانسکرپشن فیکٹرز، اور براہ راست اینٹی وائرل افعال کے ساتھ پروٹین، نیز مدافعتی ردعمل کے منفی ریگولیٹرز9 شامل ہیں۔آئی ایس جی کی سرگرمی کے بارے میں زیادہ تر معلومات اوور ایکسپریشن اسکرینز 10,11 یا جین سائیلنسنگ تکنیک (siRNA, RNAi اور CRISPR) 12,13 کا استعمال کرتے ہوئے فنکشنل اسکرینوں سے آتی ہیں جس میں انفرادی ISGs کا اظہار یا روکا جاتا ہے اور ان کی سرگرمی کو مختلف وائرسوں پر جانچا جاتا ہے۔اگرچہ ان مطالعات نے انفرادی ISGs کی اینٹی وائرل خصوصیات کا تعین کیا ہے، لیکن ہر ISG کے بنیادی مالیکیولر میکانزم بڑی حد تک نامعلوم ہیں۔یہ عام طور پر قبول کیا جاتا ہے کہ بہت سے پروٹین مکمل سرگرمی کو یقینی بنانے کے لیے ایک یا زیادہ سائٹوکائنز کے ساتھ تعامل کرتے ہیں، اس لیے یا تو ISGs براہ راست تعامل کرتے ہیں یا ان کے تعامل سیلولر پروٹین کے ذریعے ثالثی کیے جاتے ہیں۔مثال کے طور پر، ایک حالیہ فوٹو کراس لنکڈ پروٹومکس اسٹڈی نے ATPase VCP/p97 کو ایک بڑے IFITM3 انٹرایکشن پارٹنر کے طور پر شناخت کیا، جس کی روک تھام سے وائرل ذرات 14 کے ساتھ IFITM3 کی لائسوسومل چھانٹی، ٹرن اوور اور کوٹرانسپورٹ میں نقائص پیدا ہوتے ہیں۔امیونوپریسیپیٹیشن کا استعمال کرتے ہوئے، ہم نے VAPA، ایک vesicle سے وابستہ پروٹین کی شناخت IFITM1/2/3 کے ساتھ ایک تعامل پارٹنر کے طور پر کی ہے جو کولیسٹرول میں ثالثی وائرل میچوریشن میں ثالثی کرتا ہے، اور اس کی تصدیق خمیر دو ہائبرڈ سسٹم کا استعمال کرتے ہوئے ایک اور تحقیق سے ہوئی۔سائنسی معاونت 15 , 16 .
انفیکشن اور مہلک تبدیلی کو دبانے میں شامل ایک بنیادی حیاتیاتی عمل اینٹیجن پریزنٹیشن ہے، جو بڑے ہسٹو کمپیٹیبلٹی کمپلیکس (MHC) مالیکیولز کے ذریعے ثالثی کرتا ہے۔پیپٹائڈس (8-12 امینو ایسڈ لمبے) کلیویڈ، وقت سے پہلے ختم یا غلط فولڈ پروٹینز کو MHC-I heterodimer (MHC-I بھاری اور ہلکی زنجیروں پر مشتمل ہے، جسے β-2-مائکروگلوبلین کہا جاتا ہے؛ β2M) 17,18 میں لاد دیا جاتا ہے۔نتیجے میں مستحکم MHC-I ٹرائیمرز کو سیل کی سطح پر منتقل کیا جاتا ہے، جہاں وہ CD8+ T خلیات (cytotoxic T خلیات) 17 میں انٹرا سیلولر پیپٹائڈس پیش کرتے ہیں۔ٹی خلیے ان پیتھوجینز اور خلیوں کو پہچانتے اور تباہ کر دیتے ہیں جو ٹیومر کے لیے مخصوص اینٹیجن لے جاتے ہیں۔نتیجتاً، پیتھوجینز اور ٹیومر کے خلیے اکثر مدافعتی نگرانی سے بچنے کے لیے اینٹیجن پریزنٹیشن کے عمل کو دبا دیتے ہیں۔اس کے علاوہ، MHC-I انسانی ٹیومر کے 40-90% میں کم ہوتا ہے اور اکثر خراب تشخیص کے ساتھ منسلک ہوتا ہے۔
پیتھوجینز کا جواب دینے میں شامل جینوں کو آرام کی حالت اور فعال نقل کی حالت کے درمیان فوری طور پر تبدیل ہونا چاہیے۔لہذا، بہت سے سیلولر پروٹینوں کو مختصر مدت میں اعلی IFN مانگ کے جواب میں شامل ہونے کا قیاس کیا جاتا ہے، بشمول پروموٹر کرومیٹن 20,21 کی دوبارہ تشکیل اور ترمیم۔زیادہ تر مطالعات نے IFN کی موجودگی میں انفرادی ISG پروٹین شراکت داروں کی شناخت پر توجہ مرکوز کی ہے۔ماڈل سیل سسٹمز میں کئی پروٹومک اور ٹرانسکرپٹومک اسٹڈیز نے سیلولر لینڈ اسکیپ پر IFN کے اثر کو واضح کیا ہے۔تاہم، انٹرفیرون کے ذریعے پیدا ہونے والی حرکیات کی بڑھتی ہوئی سمجھ کے باوجود، ہم اب بھی ISGs کی شمولیت کے بارے میں بہت کم جانتے ہیں۔انٹرفیرون سگنلنگ کی پیچیدگی اور وقت پر منحصر حرکیات پر غور کرتے وقت، دو سوالات پیدا ہوتے ہیں: (i) کیا تیز رفتار سگنلنگ میں شامل ملٹی پروٹین کمپلیکس کو مستحکم کرنا اور پھنسنا ممکن ہے، اور (ii) کیا ان تعاملات کو 3D اسپیس میں نقش کیا جا سکتا ہے؟
ان مسائل کو حل کرنے کے لیے، ہم نے IFNα-حوصلہ افزائی پروٹین کے تعامل کے نیٹ ورک اور اس کی حرکیات کا مطالعہ کرنے کے لیے ماس اسپیکٹومیٹری (CLMS) کے ساتھ مل کر disuccinimide suberate-mediated کیمیکل کراس لنکنگ (DSS) کو نافذ کیا۔DSS Vivo میں پروٹین اور/یا پروٹین کمپلیکس کی قربت کی باقیات کے درمیان ہم آہنگی بانڈز کو جوڑتا ہے۔اس کے بعد کے MS تجزیہ سے مخصوص کراس لنکنگ سائٹس کا پتہ چلتا ہے جو ایک خاص پروٹین کے اندر علاقوں کی مقامی قربت کی عکاسی کرتی ہے، جسے اندرونی ربط کہا جاتا ہے، یا پروٹین کمپلیکس میں ذیلی یونٹس، جسے باہمی تعلق کہتے ہیں۔اس نقطہ نظر کا استعمال کرتے ہوئے، ہم نے کئی ناول پروٹین-پروٹین کمپلیکس کے ساتھ ساتھ انٹرفیرون سے متاثرہ ملٹی پروٹین انٹرایکشن نیٹ ورکس کی نشاندہی کی ہے۔ان نئے تعاملات کے ذیلی سیٹ کو مزید جانچ کر، ہم یہ ظاہر کرتے ہیں کہ H2BFS (H2B ہسٹون قسم FS؛ اس کے بعد H2B کہا جاتا ہے) اور MDN1 HLA-A کے لیے پابند شراکت دار کے طور پر کام کرتے ہیں۔
Flo-1 خلیات غذائی نالی کے adenocarcinoma کے وٹرو ماڈلز میں سب سے مشہور ہیں کیونکہ وہ esophageal tumors 22,23 کی اہم خصوصیات کی نقل کرتے ہیں۔تاہم، تمام ٹیومر امیونوجینک نہیں ہیں، اور اس بات کا تعین کرنے کے لیے کہ آیا Flo-1 خلیات انٹرفیرون کے علاج کے لیے جواب دیتے ہیں، ہم نے Flo-1 خلیوں کا 10 ng/ml IFNα کے ساتھ 72 گھنٹے تک علاج کیا۔Flo-1 خلیات نے pSTAT1 اور IRF1 کی ابتدائی شمولیت کو دکھایا، علاج کے 2 گھنٹے بعد شروع ہوتا ہے اور 72 گھنٹے تک جاری رہتا ہے، جس میں IRF1 (شکل 1A) کی اسٹیشنری سطح میں وقت پر منحصر کمی ہوتی ہے۔ISGs (MX1، IFITM1، OAS1/2، اور ISG15) 6 گھنٹے کے بعد مضبوطی سے حوصلہ افزائی کرتے ہوئے پائے گئے، IFNα (شکل 1A) کے کلاسک وسط اور آخری مرحلے کے ردعمل کی نقل کرتے ہوئے۔ایک ساتھ، یہ اعداد و شمار بتاتے ہیں کہ یہ سیلولر ماڈل انٹرفیرون ردعمل کا مطالعہ کرنے کے لئے استعمال کیا جا سکتا ہے.
IFNα علاج کے بعد Flo-1 خلیوں میں پروٹین کے مختلف اظہار کے ردعمل۔(A) 2، 6، 24، 48 اور 72 گھنٹے کے لیے 10 ng/ml IFNα کے ساتھ علاج کیے جانے والے Flo-1 خلیوں میں پروٹین کے اظہار کا اشارہ شدہ ISG اینٹی باڈیز کا استعمال کرتے ہوئے امیونو بلوٹ کے ذریعے تجزیہ کیا گیا۔(B) اشارہ شدہ اوقات اور ارتکاز کے لئے DSS کے ساتھ کراس لنک کرنے کے بعد پورے سیل کے نچوڑ کے Coomassie نیلے داغ والے SDS-PAGE جیل۔(C) پروٹین کراس لنکنگ کی ڈگری کا اندازہ کرنے کے لیے اسی نمونوں سے p53(DO-1) اینٹی باڈی کے ساتھ نمائندہ امیونو بلوٹ کا معائنہ کیا گیا۔
ان سیٹو پروٹین کے تعامل کے منظر نامے کو حاصل کرنے کے لیے، ہم نے DSS کا استعمال کیا، ایک وسیع پیمانے پر استعمال ہونے والا کراس لنکنگ ایجنٹ اس کی اعلی جھلی پارگمیتا اور نسبتاً کم ردعمل کے وقت کی وجہ سے۔ردعمل کا کم وقت کراس لنکڈ پروٹین کے بڑے مجموعوں کی تشکیل کو روکنے میں مدد کرتا ہے، اس طرح کراس لنکر کے استحکام کو برقرار رکھتا ہے۔ڈی ایس ایس کے زیادہ سے زیادہ ارتکاز کا تعین کرنے اور اوور کراس لنکنگ سے بچنے کے لیے، ہم نے پہلے خلیات کو بالترتیب 5، 10، 5 اور 30 ​​منٹ کے لیے 5، 2.5، اور 1 mM DSS پر ظاہر کیا، اور Coomassie-stained SDS-PAGE کے ذریعے lysates کا تجزیہ کیا۔ (ڈیٹا نہیں دکھایا گیا)۔سیل لائسیٹس سب سے کم ارتکاز اور کم سے کم وقت کے نقطہ پر انتہائی کراس لنکڈ دکھائی دیتے ہیں۔لہذا، DSS کو 5 منٹ میں 1، 0.5، اور 0.1 mM میں ٹائٹریٹ کیا گیا تھا (شکل 1B)۔0.5 ایم ایم ڈی ایس ایس کے ساتھ 5 منٹ کے لیے بہترین کراس لنکنگ کا مشاہدہ کیا گیا، اور یہ شرائط IFNα کے ساتھ علاج کیے جانے والے خلیوں کے لیے منتخب کی گئیں۔اس کے علاوہ، شکل 1C ایک مغربی دھبہ دکھاتا ہے جو p53 (DO-1) اینٹی باڈی کا استعمال کرتے ہوئے پروٹین کے کراس لنکنگ کی ڈگری کا اندازہ لگاتا ہے۔
کراس لنکر کو شامل کرنے سے پہلے Flo-1 خلیوں کا 24 گھنٹے تک 10 ng/ml IFNα کے ساتھ علاج کیا گیا۔بعد میں کراس سے منسلک خلیوں کو دو قدمی پروٹولوسیس کے ذریعے لیس کیا گیا اور FASP (تصویر 2) 24,25 کے ذریعے پروٹین پر کارروائی کی گئی۔کراس سے منسلک ٹرپٹک پیپٹائڈس کا تجزیہ ماس اسپیکٹومیٹری (تصویر 2) کے ذریعے کیا گیا۔اس کے بعد MS/MS سپیکٹرا کو پروٹین کی ترتیب سے ملایا جاتا ہے اور MaxQuant26,27 کے ساتھ مقدار درست کی جاتی ہے۔SIM-XL پروگرام کا استعمال کرتے ہوئے حاصل کردہ سپیکٹرا سے کراس سے منسلک پیپٹائڈس کی شناخت کی گئی، اور انفرادی مرکبات کو xQuest28 اور SIM-XL29 اوپن سورس کمپیوٹنگ سافٹ ویئر پائپ لائنز (تصویر 2) کا استعمال کرتے ہوئے ایک پیچیدہ نیٹ ورک میں ملایا گیا۔SIM-XL سادہ یا پیچیدہ پروٹین کے مرکب میں پروٹین-پروٹین کے تعاملات، اندرونی زنجیروں اور انفرادی زنجیروں کی شناخت کرتا ہے اور پروٹین کے ڈھانچے میں تعاملات کو دیکھنے کے لیے اسکرپٹ فراہم کرتا ہے۔اس کے علاوہ، یہ MS/MS29 سپیکٹرم کے معیار کے مطابق ID سکور کے طور پر ہر ایک کراس ریفرنس کی درجہ بندی کرتا ہے۔کئی انتہائی قابل اعتماد پروٹین-پروٹین تعاملات اور کمپلیکسز کی نشاندہی کی گئی ہے، اور تعاملات کے ایک نئے سیٹ کی مزید تفتیش کی گئی ہے جو کو-امیونوپریسیپیٹیشن اور مالیکیولر ڈائنامکس (MD) ماڈلنگ (تصویر 2) 30، 31 کا استعمال کرتے ہوئے کمپلیکس کی تبدیلیوں کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا ہے۔
CLMS طریقہ کار کا اسکیمیٹک جائزہ۔Flo-1 خلیوں کا علاج 10 ng/ml IFNα کے ساتھ 24 گھنٹوں تک کیا گیا جس کے بعد DSS کا استعمال کرتے ہوئے سیٹو پروٹین کراس لنکنگ کے بعد سیل لیسز اور ٹرپسنائزیشن کی گئی۔آربیٹریپ ماس اسپیکٹومیٹر کا استعمال کرتے ہوئے کراس سے منسلک نمونوں کا تجزیہ کیا گیا اور LC-MS/MS کے دوران پیپٹائڈ پیشگیوں کے ٹکڑے کرنے کے لیے مزید نمونے لیے گئے۔کراس لنکڈ پیپٹائڈس (SIM-XL) پروگرام کی سپیکٹرم ریکگنیشن مشین کا استعمال کرتے ہوئے حاصل کردہ سپیکٹرا سے دو منسلک پیپٹائڈس کی شناخت کی گئی تھی، اور تمام مرکبات کو کمپیوٹیشنل پائپ لائنز کا استعمال کرتے ہوئے ایک پیچیدہ نیٹ ورک میں ملا دیا گیا تھا۔غلط مثبت شرح (FDR) اسکورز کی بنیاد پر کم اعتماد کے تعاملات کو فلٹر کریں۔متعدد نئے ہائی فیڈیلیٹی پروٹین-پروٹین تعاملات کی مزید تصدیق کو-امیونوپریسیپیٹیشن کا استعمال کرتے ہوئے کی گئی، اور مالیکیولر ڈائنامکس (MD) ماڈلنگ کا استعمال کرتے ہوئے کمپلیکس میں تبدیلیوں کی جانچ کی گئی۔
مجموعی طور پر ~30,500 اور ~28,500 پیپٹائڈس کا پتہ لگایا گیا میکس کوانٹ کا استعمال کرتے ہوئے غیر متحرک اور محرک IFNα نمونوں میں، بالترتیب (ضمنی جدول S1، تصویر 3A)۔دونوں صورتوں میں پیپٹائڈ کی لمبائی کی تقسیم نے بڑے پیپٹائڈس کا زیادہ تناسب ظاہر کیا، جو کراس لنکڈ پیپٹائڈس کی موجودگی کی نشاندہی کرتا ہے (تصویر 3B،C)۔اس کے علاوہ، بڑے پیپٹائڈس کا ایک بڑا تناسب IFNα-علاج شدہ نمونوں (تصویر 3C) میں 40–55 رینج میں موجود تھا۔لاگ 2 کی شدت کے خلاف پروٹین میپنگ سے پتہ چلتا ہے کہ علاج نہ کیے جانے والے نمونوں کے مقابلے میں کلاسک انٹرفیرون محرک پروٹین سب سے زیادہ پائے جاتے ہیں، بشمول MX1، IFIT1/3، OAS2/3، DDX58، اور HLA-F (شکل 3D)۔ری ایکٹوم پاتھ وے ڈیٹا بیس کا استعمال کرتے ہوئے IFNα علاج کے جواب میں تین گنا سے زیادہ افزودہ پروٹین کے راستوں کے تجزیے سے پتہ چلتا ہے کہ MHC-I-ثالثی اینٹیجن پریزنٹیشن اور پروسیسنگ سب سے زیادہ غالب راستہ تھا (شکل 3E)۔پچھلی رپورٹوں سے مطابقت رکھتے ہوئے، OAS اور ISG15 کے ذریعے ثالثی کی گئی اینٹی وائرل ردعمل کے ساتھ ساتھ IFNα/β اور سائٹوکائن سگنلنگ فعال ہونے والے راستوں میں شامل تھے۔اس کے علاوہ، lysine- اور serine-specific پروٹین کراس لنکس کی شناخت SIM-XL کا استعمال کرتے ہوئے اصل میں حاصل کردہ MS/MS سپیکٹرا سے کی گئی۔ایک حالیہ مطالعہ نے 5 سیل اقسام میں انفرادی ISG اوور ایکسپریشن اسٹڈیز کے میٹا تجزیہ کے ذریعہ 9 وائرس کلاسوں میں سے 20 وائرس پر پھیلے ہوئے 104 ISGs کی اطلاع دی ہے۔تاہم، بڑے ڈیٹاسیٹس کی اسکریننگ کی کمپیوٹیشنل حدود پر قابو پانے کے لیے، ہم نے ایک چھوٹے ڈیٹاسیٹ کے ساتھ شروع کیا تاکہ پڈاریا ایٹ ال کے ذریعہ رپورٹ کردہ IRDS جینوں کی فہرست کے درمیان ممکنہ تعاملات کو تلاش کیا جا سکے، جن میں سے زیادہ تر ISGs ہیں۔
IFNα (میکس کوانٹ سے حاصل کردہ ڈیٹا) کے جواب میں مختلف طور پر اظہار کردہ کراس سے منسلک پروٹین کی شناخت۔(A) وین ڈایاگرام جو IFNα14 علاج شدہ اور غیر علاج شدہ Flo-1 نمونوں میں شناخت شدہ عام اور خصوصی پیپٹائڈس کی تعداد کی نمائندگی کرتا ہے۔غیر علاج شدہ (B) اور IFNα علاج شدہ (C) کراس لنکڈ نمونوں کی پیپٹائڈ لمبائی کی تقسیم۔(D) غیر علاج شدہ اور IFNα14 علاج شدہ Flo-1 خلیوں کے درمیان log2 (LFQ کی شدت) کی نمائندگی کرنے والا حرارت کا نقشہ۔بائیں پینل IFNα کی موجودگی میں سب سے زیادہ فعال طور پر فعال پروٹین دکھاتا ہے۔(E) ہسٹوگرام IFNα علاج کے بعد افزودگی کے 20 بڑے راستوں کی نمائندگی کرتا ہے۔ری ایکٹوم پاتھ وے ڈیٹا بیس نے اپریگولیٹڈ IFNα- جوابی پروٹین میں چار گنا سے زیادہ تبدیلیوں کا تجزیہ کیا۔
انٹرفیرون کی ثالثی آئی ایس جی محرک کو اچھی طرح سے دستاویزی شکل دی گئی ہے، لیکن سالماتی سطح پر یہ اچھی طرح سے نہیں سمجھا جاتا ہے کہ یہ پروٹین حیاتیاتی افعال کی ایک وسیع رینج میں کیسے اختتام پذیر ہوتے ہیں۔ہم نے معروف ISGs کے درمیان اعلی درجے کے اعتماد کے ساتھ پروٹین کے تعامل کی تحقیقات کی۔دلچسپ بات یہ ہے کہ ہم نے ایک نیٹ ورک کی نشاندہی کی جس میں MX1، USP18، ROBO1، OAS3، اور STAT1 پروٹین شامل ہیں جو IFNα علاج (شکل 4، ٹیبل S2) 32,33,34 کے جواب میں ایک بڑا کمپلیکس بناتے ہیں۔سب سے اہم بات یہ ہے کہ یہ تعاملات IFNα کے ساتھ علاج کیے جانے والے تمام ٹرپلیکیٹس میں پائے گئے تھے اور غیر علاج شدہ نمونوں میں نہیں پائے گئے تھے، یہ تجویز کرتے ہیں کہ وہ خاص طور پر IFNα علاج کے جواب میں تشکیل دیے گئے تھے۔یہ جانا جاتا ہے کہ STAT1 نقل کے طور پر ان ISGs کے اظہار کو منظم کرتا ہے، لیکن ISGs کے ساتھ پروٹین کی سطح پر اس کے تعامل کا مطالعہ نہیں کیا گیا ہے۔STAT1 کے کرسٹل ڈھانچے نے ظاہر کیا کہ اس کا ہیلیکل ڈومین (CCD) dimers35 کی تشکیل کے دوران DNA یا protomers کے ساتھ تعامل میں شامل نہیں ہے۔یہ α-helices ایک ہیلیکل ہیلکس ڈھانچہ تشکیل دیتے ہیں جو تعاملات کے لیے بنیادی طور پر ہائیڈرو فیلک سطح کا علاقہ فراہم کرتا ہے 35۔ہمارے CLMS ڈیٹا میں، ہم نے مشاہدہ کیا کہ STAT1 کے ساتھ زیادہ تر تعاملات SH2 ڈومین میں CCD، لنکر ڈومین، یا C-ٹرمینل ٹیل (اوشیشوں 700-708) (شکل 4A) سے پہلے ہوئے ہیں۔پچھلے مطالعے میں بتایا گیا ہے کہ USP18 STAT2 کے CCD اور DNA بائنڈنگ ڈومین (DBD) سے منسلک ہے اور قسم I انٹرفیرون سگنلنگ 24 کی روک تھام میں ثالثی کے لیے قسم I انٹرفیرون ریسیپٹر IFNAR2 کے ذیلی یونٹ میں بھرتی کیا گیا ہے۔ہمارے ڈیٹا نے یہ بھی دکھایا کہ USP18 کیٹلیٹک ڈومین STAT1 DBD (Figure 4A,D) کے ساتھ تعامل کرتا ہے، یہ تجویز کرتا ہے کہ STAT1 اور STAT2 دونوں USP18 کو IFNAR2 کی طرف راغب کرنے میں کردار ادا کر سکتے ہیں۔
IFNα کے ساتھ علاج کیے جانے والے کراس سے منسلک خلیوں میں پروٹین-پروٹین ISG نیٹ ورک کی شناخت کی گئی ہے۔(A) 2D تعامل کا پلاٹ جو پروٹین-پروٹین کے تعاملات کو دکھاتا ہے (SIM-XL پروگرام میں تیار کیا گیا ہے)، لائنوں کے ساتھ جو بین مالیکیولر تعاملات کی نمائندگی کرتی ہیں (کراس لنک کٹ آف سیٹ 3.5)۔مختلف شناختوں کے ڈومینز کو ان کے رنگ 32 سے نشان زد کیا گیا ہے: MX1 ڈومین، Dynamin_N (73–249)، Dynamin_M (259–547)، اور GED (569–660)۔OAS3 ڈومینز: OAS1_C (160-344)، OAS1_C (559-745)، NTP_transf_2 (780-872)، اور OAS1_C (903-108)۔ڈومین ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) اور fn3 (777–864)۔STAT1 فیلڈز: STAT_int (2–120)، STAT_alpha (143–309)، STAT_bind (321–458)، SH2 (573–657)، اور STAT1_TAZ2bind (715–739)۔(B) بالترتیب نیلے اور سرخ میں لیبل لگائے گئے تعاملات اور تعاملات کے ساتھ کراس سے منسلک پروٹین (MX1، UBP18، OAS3، ROBO1، اور STAT1) کا سرکلر ناظر۔کراس لنک کی حد 3.5 پر سیٹ کی گئی تھی۔ڈاٹ پلاٹ MX1 (C)، USP18 (D)، ROBO1 (E)، اور OAS3 (F) کے ساتھ STAT1 تعامل کی سائٹس کے ساتھ ساتھ K یا S دو پیپٹائڈس کے درمیان تعامل کی سائٹس کی نشاندہی کرتے ہیں۔تصویر میں، کراس لنک سکور کی حد 3.0 پر سیٹ کی گئی ہے۔(G) STAT1 اور OAS3 DI ڈومینز کے درمیان مختلف تعامل کی سائٹس جو PyMol (PyMOL مالیکیولر گرافکس سسٹم، ورژن 2.0 Schrödinger, LLC) میں ان کے پروٹین ڈھانچے پر قائم ہیں؛STAT1 (pdb id: 1bf533) اور OAS3 (pdb id: 4s3n34)۔) پروگرام۔
انسانوں میں یو ایس پی 18 کے دو آئسفارمز بیان کیے گئے ہیں، ایک مکمل طوالت والا پروٹین جو بنیادی طور پر نیوکلئس میں واقع ہوتا ہے، اور ایک آئسفارم بغیر این ٹرمینل ڈومین، USP18-sf، جو کہ سائٹوپلازم اور نیوکلئس 36 میں یکساں طور پر تقسیم ہوتا ہے۔اس کے علاوہ، N-terminus کے غیر ساختہ ہونے کی پیش گوئی کی گئی تھی اور اسے isopeptidase سرگرمی یا ISG1537 بائنڈنگ کی ضرورت نہیں ہے۔ہمارے مطالعے میں جن تعاملات کی نشاندہی کی گئی ہے ان میں سے زیادہ تر پروٹین کے N-ٹرمینس پر واقع تھے، یہ تجویز کرتے ہیں کہ ان تعاملات میں پوری لمبائی کا USP18 (شکل 4A، D) شامل ہے اور اس طرح ممکنہ طور پر نیوکلئس میں واقع ہوتا ہے۔مزید یہ کہ ہمارے اعداد و شمار یہ بھی بتاتے ہیں کہ N-terminus پروٹین سے پروٹین کے تعامل کے لیے مخصوص ہے۔IFNAR2 بائنڈنگ سائٹ باقیات 312-368 کے درمیان واقع ہے، اور خاص طور پر، کمپلیکس میں موجود کوئی بھی پروٹین اس خطے (تصویر 4A) 37,38 سے منسلک نہیں ہے۔یہ اعداد و شمار ایک ساتھ لے کر اشارہ کرتے ہیں کہ IFNAR2 بائنڈنگ ڈومین خصوصی طور پر ریسیپٹر پروٹین کے ذریعہ استعمال ہوتا ہے۔اس کے علاوہ، صرف OAS3 اور ROBO1 N-ٹرمینس اور IFNAR2 بائنڈنگ سائٹ (شکل 4A) کے اوپر والے ڈومینز سے وابستہ پائے گئے۔
ROBO1 کا تعلق ٹرانس میبرن سگنلنگ مالیکیولز کی انتہائی فیملی امیونوگلوبلین (Ig) سے ہے اور یہ ایکسٹرا سیلولر ریجن میں پانچ Ig ڈومینز اور تین fibronectin (Fn) ڈومینز پر مشتمل ہے۔ان ایکسٹرا سیلولر ڈومینز کے بعد ایک جھلی-قریبی خطہ اور ایک واحد ٹرانس میمبرن ہیلکس 39 ہوتا ہے۔ ایک غیر ساختہ انٹرا سیلولر خطہ C-ٹرمینس پر واقع ہے اور اس میں محفوظ ترتیب کے نقش ہوتے ہیں جو انفیکٹر پروٹین بائنڈنگ میں ثالثی کرتے ہیں۔امینو ایسڈ ~ 1100 سے 1600 تک پھیلا ہوا خطہ زیادہ تر خراب ہے۔ہم نے پایا کہ MX1 ROBO1 کے ساتھ Ig، Fn، اور انٹرا سیلولر ڈومینز کے ذریعے تعامل کرتا ہے، جبکہ STAT1 کے ساتھ زیادہ تر تعامل اس کے CCD، لنکر ڈومین، اور ROBO1 کے C-ٹرمینس (تصویر 4A,E) کے درمیان ہوتے ہیں۔دوسری طرف، DI، DIII، اور OAS3 لنکر علاقوں کے ساتھ تعاملات پورے ROBO1 پروٹین (تصویر 4A) میں تقسیم کیے گئے تھے۔
oligoadenylate synthase (OAS) پروٹین فیملی انٹرا سیلولر ڈبل سٹرینڈڈ RNA (dsRNA) کو قبول اور باندھتا ہے، تبدیلیوں سے گزرتا ہے، اور 2′,5′ سے منسلک oligoadenylates (2-5 As) 40 کی ترکیب کرتا ہے۔یہ پایا گیا کہ تین OAS میں سے، OAS3 dsRNA کے لیے سب سے زیادہ وابستگی کا مظاہرہ کرتا ہے اور کم سے کم 2-5 As کی ترکیب کرتا ہے، جو RNase L کو چالو کر سکتا ہے اور اس طرح وائرل نقل 41 کو محدود کر سکتا ہے۔OAS فیملی پولیمریز بیٹا (pol-β) جیسے نیوکلیوٹائڈ ٹرانسفراز ڈومینز پر مشتمل ہے۔پچھلی تحقیق سے پتہ چلتا ہے کہ C-ٹرمینل ڈومین (DIII) کی کیٹلیٹک سرگرمی کا انحصار dsRNA- بائنڈنگ ڈومین (DI) پر ہے، جو OAS342 کو چالو کرنے کے لیے ضروری ہے۔ہم نے مشاہدہ کیا کہ OAS3 کے DI اور DII ڈومینز CCD اور SH2 اور STAT1 TAD (شکل 4A, F) کے درمیان ایک چھوٹے سے جنکشن والے علاقے کے ساتھ تعامل کرتے ہیں۔پروٹین کے ڈھانچے پر مختلف کراس لنکنگ سائٹس کو اوورلے کرنے سے β-sheet اور DBD STAT1 لوپ اور OAS3 (تصویر 4G) کے DI ڈومین میں 60–75 کی باقیات کے ذریعے بننے والی ایک کھلی جیب یا گہا کے درمیان تعامل کا انکشاف ہوا۔کمپلیکس میں پروٹینوں کی واقفیت نے یہ بھی اشارہ کیا کہ OAS3 کے ساتھ کسی بھی تعامل نے اس کے DI ڈومین (تصویر S1A) کی ڈی این اے بائنڈنگ صلاحیت میں مداخلت نہیں کی۔اس کے علاوہ، GTPase MX1 کا N-ٹرمینل ڈومین OAS3 (تصویر 4A) کے DI اور DIII ڈومینز کے ساتھ بڑے پیمانے پر تعامل کرتا ہے۔ہم نے OAS1 اور MX1 کے درمیان تعامل کا مشاہدہ بھی کیا ان تینوں IFNα-علاج شدہ تکرار میں، جہاں ایک واحد OAS1 ڈومین (بھی اتپریرک طور پر فعال) نے تینوں MX1 ڈومینز (شکل S2A، B) کے ساتھ تعامل کیا۔
MX پروٹین ڈائنین نما GTPases کے ایک بڑے خاندان کا حصہ ہیں جس میں ایک N-ٹرمینل GTPase ڈومین ہوتا ہے جو GTP کو باندھتا ہے اور ہائیڈولائز کرتا ہے، ایک انٹرمیڈیٹ ڈومین جو خود اسمبلی میں ثالثی کرتا ہے، اور ایک C-ٹرمینل لیوسین زپ جو GTPase (LZ) کے طور پر کام کرتا ہے۔ )۔ڈومین اثر ڈومین 25,43۔MX1 وائرل جین کی نقل کو روکنے کے لیے وائرل پولیمریز کے ذیلی یونٹس سے منسلک ہوتا ہے۔پہلے اطلاع دی گئی خمیر دو ہائبرڈ اسکرین سے پتہ چلتا ہے کہ PIAS1 سے وابستہ MX1 DNA-بائنڈنگ سرگرمی کو روک کر STAT1-ثالثی جین ایکٹیویشن کو روکتا ہے اور اس میں SUMO E344,45 ligase سرگرمی بھی ہے۔یہاں، ہم یہ ظاہر کرتے ہیں کہ MX1 STAT1 (Figure 4C,D) سے منسلک ہے، تاہم یہ تعامل IFNα کے جواب میں STAT1-ثالثی جین ایکٹیویشن کو کیسے متاثر کرتا ہے اس کے لیے مزید مطالعہ کی ضرورت ہے۔اس کے علاوہ، ہم نے یہ بھی پایا کہ MX1 نے IFIT3 اور DDX60 کے ساتھ ان تینوں IFNα-علاج شدہ تکرار (تصویر S2C) میں بات چیت کی۔
DDX60 ایک IFN-حوصلہ افزائی cytoplasmic helicase ہے جو پہلے وائرل RNA46 کے RIG-I-آزاد انحطاط میں کردار ادا کرنے کی اطلاع دی گئی ہے۔یہ RIG-I کے ساتھ تعامل کرتا ہے اور اس کے سگنلنگ کو ligand کے مخصوص انداز میں چالو کرتا ہے۔MX1 اور IFIT3 کے ساتھ اس کے زیادہ تر تعاملات طویل N- اور C-ٹرمینل خطوں میں بغیر کیننیکل ڈومینز یا شکلوں کے ہوتے ہیں (تصویر S2E,F)۔تاہم، MX1 کا تعلق DEXD/H-Box ہیلیکیس ڈومین (تصویر S2E) سے بھی ہے۔IFIT خاندان کے پروٹینوں میں ایک مخصوص ہیلکس-ٹرن-ہیلکس شکل کی ٹینڈم کاپیاں ہوتی ہیں جسے ٹیٹراپپٹائڈ ریپیٹ (TPR) کہتے ہیں۔IFIT3 RIG-I سگنلنگ کا ایک مثبت ماڈیولر پایا گیا اور اس وجہ سے MAVS کمپلیکس کا ایک جزو ہے۔ایک ساتھ لیا گیا، ہمارے اعداد و شمار بتاتے ہیں کہ IFIT3 اور DDX60 بنیادی طور پر IFIT3 کے TPR 3–6 کے درمیان کے علاقے میں بات چیت کرتے ہیں اور RIG-I/MAVS سگنلنگ (تصویر S2F) میں کردار ادا کر سکتے ہیں۔
یہ دیکھتے ہوئے کہ پورے پروٹوم کی اسکریننگ کمپیوٹیشنل طور پر انتہائی گہری ہے، اس کے بعد ہم نے IFNα سے علاج شدہ تکرار میں سے ایک کی موجودگی کے لیے پورے انسانی UniProt ڈیٹا بیس کی اسکریننگ کی۔اس نقل میں، ہمیں HLA-A کے لیے متعدد انتہائی قابل اعتماد تعامل کے نیٹ ورک ملے۔MS/MS سپیکٹرا کے ذریعے شناخت کیے گئے پروٹین کے راستوں کے تجزیے سے پتہ چلتا ہے کہ MHC-I پر مبنی اینٹیجن پروسیسنگ اور پریزنٹیشن انٹرفیرون (تصویر 3D) کے ذریعے حاصل ہونے والا بنیادی راستہ ہے۔لہذا، ہم نے MHC-I مالیکیولز کے پروٹین کے تعاملات کا مطالعہ کرنے پر توجہ مرکوز کی جس میں تمام کراس سے منسلک نمونوں میں اعلیٰ اعتماد کے ساتھ۔HLA α1، α2 اور α3 ڈومینز اور لائٹ چینز پر مشتمل ہوتا ہے، اور مائیکروگلوبلین β2 (β2m) ایک مستقل چیپرون پروٹین49 ہے۔ایک بار اینڈوپلاسمک ریٹیکولم میں جمع ہونے کے بعد، پیپٹائڈ لیگینڈز 50 کی غیر موجودگی میں ایچ ایل اے غیر مستحکم ہے۔پیپٹائڈ بائنڈنگ گروو غیر پیپٹائڈ فارم میں انتہائی پولیمورفک اور غیر ساختہ α1 اور α2 ڈومینز اور نسبتاً کم پولیمورفک α351 ڈومین سے بنتا ہے۔IFNα کی موجودگی میں، ہمیں دو HLA-A کمپلیکسز کا پتہ چلا: ایک HMGA1 اور H2B (شکل 5، ٹیبل S3) کے ساتھ تعامل کرتا ہے اور دوسرا MDN1، LRCH4 اور H2B (شکل 6) کے ساتھ تعامل کرتا ہے۔
IFNα H2B (H2BFS) اور HMGA1 کے ساتھ ایک HLA-A تعامل کے نیٹ ورک کی حوصلہ افزائی کرتا ہے۔(A) 2D پلاٹ (SIM-XL سافٹ ویئر میں تیار کردہ) H2B-HLA-A-HMGA1 کمپلیکس میں مختلف قسم کے تعاملات کی عکاسی کرتا ہے: انٹر لنک (نیلے)، انٹر لنک (سرخ) اور سنگل لنک (سیاہ)۔.مختلف شناختوں کے ڈومینز کلر کوڈڈ 32 ہیں: H2B (ہسٹون؛ 2–102) اور MHC-I (MHC_1؛ 25–203، گروپ C1؛ 210–290 اور MHC_I_C؛ 337–364)۔کراس لنک کی حد 3.5 پر سیٹ کی گئی تھی۔ڈاٹ پلاٹ H2B (B) اور HMGA1 (C) کے ساتھ HLA-A تعامل کی جگہوں کے ساتھ ساتھ دو پیپٹائڈس کے درمیان K یا S تعامل کی جگہوں کی نشاندہی کرتے ہیں۔تصویر میں، کراس لنک سکور کی حد 3.0 پر سیٹ کی گئی ہے۔(D) PyMOL پروگرام میں H2B، HLA-A، اور HMGA1 پروٹین کے ڈھانچے میں دکھائے گئے پروٹینوں کے درمیان تعلقات۔ان ڈھانچے کو Phyre2 سرور (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) کا استعمال کرتے ہوئے ماڈل بنایا گیا تھا اور H2B، HLA-A اور HMGA1 پروٹین کے ٹیمپلیٹ ڈھانچے بالترتیب 1kx552، 1kj349 اور 2eze55 تھے۔
IFNα H2B (H2BFS)، MDN1 اور LRCH4 کے ساتھ ایک HLA-A تعامل کے نیٹ ورک کی حوصلہ افزائی کرتا ہے۔(A) انٹرمولیکیولر (سرخ) اور انٹرمولیکیولر (نیلے) کراس لنکس 2D انٹرایکٹو نقشہ (SIM-XL سافٹ ویئر میں تیار کردہ) پر MDN1 کے ساتھ دائرے کے طور پر پیش کیے گئے ہیں۔کراس لنک کی حد 3.5 پر سیٹ کی گئی تھی۔مختلف شناختوں کے ڈومینز کلر کوڈڈ 32 ہیں: H2B (ہسٹون؛ 2–102)، MHC-I (MHC_1؛ 25–203، گروپ C1؛ 210–290 اور MHC_I_C؛ 337–364) اور LRCH4 (LRR_8 (68–126)، LRR_8 (137–194) اور CH (535–641))۔(B) PyMOL پروگرام میں H2B، HLA-A، LRCH4، اور MDN1 پروٹین کے ڈھانچے میں دکھائے گئے پروٹین کے درمیان تعلقات۔ان ڈھانچے کو Phyre2 سرور (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) کا استعمال کرتے ہوئے ماڈل بنایا گیا تھا جس میں H2B، HLA-A، LRCH4 اور MDN1 پروٹینز کے لیے ٹیمپلیٹ ڈھانچے 1kx552، 1kj349، 6hlu62 اور 6i2665، بالترتیبڈاٹ پلاٹ H2B (C)، LRCH4 (D)، اور MDN1 (E) کے ساتھ HLA-A کے لیے K یا S تعامل کی سائٹس دکھا رہے ہیں۔پلاٹوں کے لیے، کراس لنک سکور کی حد 3.0 پر سیٹ کی گئی تھی۔
جینوم کی سالمیت کو برقرار رکھنے کے علاوہ، ہسٹون H2B نقل کے ضابطے میں بھی شامل ہے۔H2B پروٹین ایک مرکزی ہسٹون ڈومین (HFD) پر مشتمل ہوتا ہے جو تین α-ہیلائسز کے ذریعے الگ ہوتا ہے اور ایک C-ٹرمینل ٹیل 41,52 ہوتا ہے۔H2B کے ساتھ زیادہ تر تعامل α1 ہیلکس میں ہوتا ہے، جو HFD heterodimer (تصویر 5A,B) کے ساتھ ٹرائیمرائزیشن فراہم کرتا ہے۔اگرچہ lysins DNA بائنڈنگ میں شامل ہیں، کچھ lysins متبادل ایسٹیلیشن یا میتھیلیشن سائٹس بھی ہیں۔مثال کے طور پر، H2B سے K43، K46، اور K57 کی باقیات براہ راست DNA بائنڈنگ میں شامل نہیں ہیں، لیکن نقل کے بعد کی مختلف تبدیلیوں کا ہدف ہیں۔اسی طرح، H2B میں K44، K47، اور K57 باقیات IFNα کی موجودگی میں متبادل کردار ادا کر سکتے ہیں، بشمول دیگر پروٹینز کے ساتھ تعامل (تصویر 5A، B)۔اس کے علاوہ، ایکسٹرا کروموسومل ہسٹون H2B مختلف قسم کے خلیوں میں مدافعتی ردعمل کو متحرک کرتا ہے، جو ایک سائٹوسولک سینسر کے طور پر کام کرتا ہے تاکہ متعدی ایجنٹوں یا خراب خلیوں سے حاصل ہونے والے دوہرے پھنسے ہوئے DNA (dsDNA) کے ٹکڑوں کا پتہ لگایا جا سکے۔DNA وائرس کی موجودگی میں، H2B کی کمی نے IFN-β کی پیداوار اور STAT154 فاسفوریلیشن کو روک دیا۔H2B دوسرے بنیادی ہسٹونز کے مقابلے میں نیوکلئس کے اندر اور باہر تیزی سے حرکت کرنے کے لیے بھی جانا جاتا ہے۔منتخب غیر علاج شدہ نمونوں میں MDN1 اور LRCH4 کے ساتھ H2B تعاملات بھی دیکھے گئے۔ہم نے پایا کہ HLA-A نے H2B کے ساتھ تینوں IFNα- علاج شدہ نمونوں میں اور ایک علاج نہ کیے گئے دوبارہ نمونے میں بات چیت کی۔یہ اعداد و شمار ٹرانسکرپشن ریگولیشن سے آزاد متبادل جسمانی فعل میں H2B کے کردار کی عکاسی کرتے ہیں۔
HMGA1 (ہائی موبلٹی گروپ AT-Hook 1)، بیماری کو فروغ دینے والے امینو ایسڈ سے بھرپور ایک چھوٹا نیوکلیوپروٹین، HLA-A کے ساتھ مل کر شناخت کیا گیا ہے۔اس میں ایک تیزابی سی ٹرمینل دم اور تین الگ الگ DBDs ہیں جنہیں AT ہکس کہتے ہیں کیونکہ وہ dsDNA55,56 میں AT سے بھرپور خطے کی معمولی نالی سے منسلک ہوتے ہیں۔یہ بائنڈنگ ڈی این اے کو موڑنے یا سیدھا کرنے کا سبب بنتی ہے، جس سے کینونیکل ٹرانسکرپشن عوامل کو اس کے متفقہ ترتیب تک رسائی حاصل ہوتی ہے۔خیال کیا جاتا ہے کہ سی ٹرمینل ٹیل پروٹین-پروٹین کے تعامل اور ٹرانسکرپشن عوامل کی بھرتی میں ملوث ہے، کیونکہ سی ٹرمینل ڈیلیٹ کرنے والے اتپریورتی نقل کو شروع کرنے سے قاصر ہیں۔مزید یہ کہ اس ڈومین میں کئی محفوظ شدہ فاسفوریلیشن سائٹس شامل ہیں جو کنیز 58 کے لیے سبسٹریٹس کے نام سے مشہور ہیں۔ہم نے C-ٹرمینل ڈومین کے باہر HMGA1 کے ساتھ HLA-A اور H2B تعاملات کا مشاہدہ کیا، جس سے معلوم ہوتا ہے کہ C-ٹرمینل ڈومین بنیادی طور پر ٹرانسکرپشن فیکٹر بائنڈنگ (تصویر 5A, C) کے لیے استعمال ہوتا ہے۔ایچ ایم جی اے پروٹین اڈاپٹر ڈی این اے کے پابند ہونے کے لیے ہسٹون H1 کے ساتھ مقابلہ کرتے ہیں، اس طرح رسائی میں اضافہ ہوتا ہے57۔اسی طرح، ایسا لگتا ہے کہ HMGA ہسٹون H2B کے ساتھ ہسٹون H1 کے مقابلے میں لنکر DNA کے ساتھ تعامل کرتا ہے۔HMGB1 ڈینڈریٹک خلیوں میں HLA-A، -B، اور -C کے اظہار کی حوصلہ افزائی کرتا ہے، جس سے ان کی ایکٹیویشن59 ہوتی ہے، لیکن HMG اور HLA کے درمیان تعامل کی پہلے اطلاع نہیں دی گئی ہے۔ہم نے پایا کہ HMGA1 HLA-A کے α1 اور α3 ڈومینز کے ساتھ تعامل کرتا ہے، اس کے 3 DBD (شکل 5A,C) سے باہر زیادہ تر تعاملات کے ساتھ۔ہمارے ہاتھوں میں، HLA-A کو نیوکلئس میں مقامی پایا گیا (ڈیٹا نہیں دکھایا گیا)، اور یہ دیکھتے ہوئے کہ H2B اور HMGA1 بھی نیوکلئس میں موجود ہیں، یہ تعامل ممکنہ طور پر نیوکلئس میں ہوتا ہے۔H2B، HLA-A، اور HMGA1 کے درمیان ماپا جانے والے مخصوص نشے کو شکل 5D میں دکھایا گیا ہے۔
HLA-A کے دوسرے پروٹین کے ساتھ زیادہ تر تعاملات اس کے α1 اور α2 ڈومینز اور بے ترتیب سی-ٹرمینل ڈومین (تصویر 6) کے اندر ہوتے ہیں۔ان مثالوں میں سے ایک میں، ہم نے پایا کہ HLA-A LRCH4 (شکل 6A، D) کے غیر منقولہ N-ٹرمینل دم کے ساتھ تعامل کرتا ہے۔LRCH4 TLR4 ایکٹیویشن اور LPS سائٹوکائن انڈکشن کو ریگولیٹ کرتا ہے، اس طرح 60,61 کے پیدائشی مدافعتی ردعمل کو ماڈیول کرتا ہے۔یہ ایک جھلی پروٹین ہے جس میں نو لیوسین سے بھرپور ریپیٹس (LRRs) اور اس کے ایکٹوڈومین میں ایک کیلموڈولن (CH) ہومولوجی شکل ہے، اس کے بعد ٹرانس میبرن ڈومین (TMD) 60، 62 ہے۔CH ڈومینز کو پروٹین-پروٹین تعاملات 60 میں ثالثی کرنے کی اطلاع دی گئی ہے۔LRR اور CH ڈومینز کے درمیان تقریباً 300 امینو ایسڈز کا ایک حصہ نسبتاً قابل رسائی ہے لیکن بے ترتیب ہے۔پروٹین-پروٹین نیٹ ورکس اور ویسکولر ٹرانسپورٹ 63 کے ثالث کے طور پر ناکارہ خطوں کے کام کی بنیاد پر، ہم نے پایا کہ زیادہ تر پروٹین کے تعاملات خراب علاقوں میں ہوتے ہیں۔MDN1 کے ساتھ تعاملات پروٹین کی پوری لمبائی میں تقسیم کیے گئے تھے، بشمول LRR1، LRR6، CH ڈومینز، اور بے ترتیب علاقوں، جبکہ H2B بنیادی طور پر CH ڈومین (تصویر 6A، B) کے پابند ہیں۔خاص طور پر، کسی بھی تعامل میں TMJ شامل نہیں تھا، جو CLMS اپروچ (شکل 6A، B) کی مخصوصیت کا مشورہ دیتا ہے۔
MDN1 کی شناخت HLA-A پروٹین نیٹ ورک (شکل 6A) کے حصے کے طور پر بھی کی گئی ہے۔یہ پروٹین کے AAA خاندان سے تعلق رکھتا ہے (مختلف سرگرمیوں سے وابستہ اے ٹی پیز)۔یہ وہی N-ٹرمینل AAA ڈومین ہے جو ہیکسامریک رنگ میں منظم ہوتا ہے اور 60S 64 رائبوسومل سبونائٹ سے اسمبلی فیکٹر کو ہٹاتا ہے۔dynein64,65,66 سے ملتا جلتا دکھائی دیتا ہے۔اس کے علاوہ، Asp/Glu امیر خطہ MIDAS ڈومین (میٹل آئن پر منحصر سائٹ) کے بعد آتا ہے۔MDN1 کے بڑے سائز (تقریباً 5600 امینو ایسڈز) اور اچھی طرح سے مطالعہ شدہ پروٹین کے ساتھ اس کی محدود ہومولوجی کی وجہ سے، انسانوں میں اس کی ساخت اور کام کے بارے میں بہت کم معلوم ہے۔ہم نے HLA-A، H2B، اور LRCH4 کو MDN1 بائنڈنگ پارٹنرز کے طور پر شناخت کیا اور PyMol (تصویر 6A,B) میں پروٹین کمپلیکس کے طور پر ان کی واقفیت کا انکشاف کیا۔یہ تینوں پروٹین AAA ڈومین، ڈائنین نما لنکر ڈومین، اور ممکنہ طور پر MIDAS MDN1 ڈومین کے ساتھ تعامل کرتے ہیں۔ایک پچھلی رپورٹ میں، بیت پروٹین کی وابستگی صاف کرنے نے MDN1 کو ہسٹون H2B67 سے وابستہ ایک پروٹین کے طور پر شناخت کیا۔اس کے علاوہ، ایک حالیہ مطالعہ نے HCT116 سیلوں میں MDN اور HLA-B کے درمیان تعامل کی بھی اطلاع دی ہے، جو ہمارے نتائج کی حمایت کرتے ہوئے، affinity-purified mass spectrometry کا استعمال کرتے ہوئے 68۔IFNα سے علاج شدہ نمونوں میں اس کمپلیکس کی شناخت انٹرفیرون سگنلنگ میں MDN1 کے لیے ایک کردار کی تجویز کرتی ہے۔
چونکہ HLA جینز انتہائی کثیر الثانی ہیں، ہم نے Flo-1 خلیات (ڈیٹا نہیں دکھایا گیا) کے RNA ترتیب دینے والے ڈیٹا سے HLA-A، -B، اور -C میپنگ کو ترتیب دینے والے ریڈز کو نکالا۔ترتیب پڑھنے کے ساتھ مطابقت رکھنے والے پیپٹائڈ کے سلسلے نے HLA-A، -B، اور -C کے درمیان ان خطوں میں نمایاں فرق ظاہر کیا جہاں HLA-A (شکل S3) میں کراس سے منسلک پیپٹائڈز واقع تھے۔اس کے علاوہ، ہم نے H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4 پروٹین کے ساتھ HLA-B/C مالیکیولز کے پروٹین سے پروٹین کراس لنکنگ کا مشاہدہ نہیں کیا۔اس سے پتہ چلتا ہے کہ HLA-A، MDN1، LRCH1 اور HMGA1 کے درمیان پایا جانے والا پروٹین کا تعامل HLA-A مخصوص ہے۔اس کے علاوہ، نان کراس لنکڈ نمونوں (ٹیبل S4) کے پروٹومک تجزیہ سے پتہ چلتا ہے کہ HLA-A میں HLA-B یا HLA-C کے مقابلے زیادہ ترتیب کوریج ہے۔HLA-A کے لیے شناخت شدہ پیپٹائڈس IFNα-علاج شدہ اور غیر علاج شدہ دونوں نمونوں میں شدت میں زیادہ تھے۔
اس بات کو یقینی بنانے کے لیے کہ یہاں جو تعاملات کی نشاندہی کی گئی ہے وہ قریبی مقامی قربت میں دو پروٹینوں کے غیر مخصوص کراس لنکنگ کی وجہ سے نہیں تھی، ہم نے مزید دو نئے HLA-A تعامل کرنے والے عوامل کو کو-امیونوپریسیپیٹیشن اسسیس انجام دے کر تصدیق کی۔اینڈوجینس MDN1 اور H2B کے ساتھ HLA-A کے تعامل کا پتہ IFNα-علاج شدہ اور غیر علاج شدہ Flo-1 خلیوں دونوں میں پایا گیا تھا (شکل 7، شکل S4)۔ہم نے تصدیق کی کہ HLA-A کو H2B نے امیونوپریسیپیٹیٹس میں پکڑا تھا اور یہ ایسوسی ایشن IFNα کے علاج کی وجہ سے تھی کیونکہ HLA-A غیر علاج شدہ خلیوں (شکل 7A) سے امیونوپریسیپیٹیٹ نمونوں میں غیر حاضر تھا۔تاہم، ہمارا ڈیٹا بتاتا ہے کہ IFNα H2B اور MDN1 کے پابند HLA-A کو مختلف طریقے سے منظم کرتا ہے۔IFNα H2B اور HLA-A کے درمیان تعلق پیدا کرتا ہے، لیکن MDN1 کے ساتھ اس کی وابستگی کو کم کرتا ہے۔ہم نے پایا کہ MDN1 کنٹرول میں HLA-A کے ساتھ منسلک تھا، اور IFNα کے اضافے نے IFNα (شکل 7B، C) کے ذریعہ MDN1 شامل کرنے سے آزاد اس تعامل کو کم کردیا۔اس کے علاوہ، HLA-A امیونوپریسیپیٹیشن نے A549 خلیات (تصویر S4) میں H2B کو پکڑ لیا، یہ تجویز کرتا ہے کہ یہ تعامل سیل کی قسم سے آزاد ہے۔ایک ساتھ مل کر، یہ نتائج H2B اور MDN1 کے ساتھ HLA-A کے انٹرفیرون ثالثی تعامل کی حمایت کرتے ہیں۔
HLA-A H2B اور MDN1 کو مشترکہ طور پر پاک کرتا ہے۔نمائندہ اینڈوجینس H2B (A) اور MDN1 (B) امیونو بلوٹس کو IFNα سے علاج شدہ Flo-1 خلیوں سے حفاظتی ٹیکوں سے بچایا گیا تھا اور اشارہ شدہ اینٹی باڈیز کی جانچ کی گئی تھی۔ماؤس اور خرگوش آئی جی جی کو منفی کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔(C) مختلف اینٹیجنز کی متعلقہ مقدار (ان پٹ) کو اشارہ شدہ اینٹی باڈیز کے خلاف امیونو بلوٹس کے ذریعہ دکھایا گیا ہے، β-ایکٹین کو لوڈنگ کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔
انٹرفیرون کی حوصلہ افزائی انتہائی قابل اعتماد کراس لنکڈ نیٹ ورکس میں سے ایک کی ساختی خصوصیات، H2B-HLA-A-HMGA1 کی چھان بین کی گئی۔ہم نے اس کمپلیکس میں شامل پروٹینوں کی تعمیری حرکیات کو سمجھنے کے لیے ایک متبادل نقطہ نظر کے طور پر مالیکیولر ڈائنامکس ماڈلنگ کا استعمال کیا (شکل 8)۔CLMS ڈیٹا سے حاصل کردہ نتائج H2B، HLA-A، اور HMGA1 پروٹین کی مختلف شکلوں کے امکان کی تجویز کرتے ہیں۔لہذا، مندرجہ ذیل ممکنہ کمپلیکس کو سالوینٹ میڈیم میں ماڈل بنایا گیا تھا: H2B-HLA-A، HMGA1-HLA-A، اور H2B-HLA-A-HMGA1۔MOE (مالیکیولر آپریٹنگ انوائرمنٹ؛ کیمیکل کمپیوٹنگ گروپ انکارپوریشن، مونٹریال، کیوبیک، کینیڈا) پیکیج کا استعمال کرتے ہوئے ایک ابتدائی پروٹین-پروٹین ڈاکنگ اسکرین نے ممکنہ تبدیلیوں کی تجویز پیش کی جو ان پروٹینوں کے درمیان مختلف ہیں (تصویر 8A)۔ڈاکنگ پروٹین کمپلیکس کے تصور سے متعدد تعاملات اور ممکنہ تبدیلیوں کا انکشاف ہوا (شکل 5A، 8)۔اس طرح، ایک ممکنہ تبدیلی کو شکل 8A میں دکھایا گیا ہے (لیبل لگے ہوئے کراس لنکس کے ساتھ) اور MD ماڈلنگ پائپ لائن کا استعمال کرتے ہوئے اس کا مزید جائزہ لیا گیا۔اس کے علاوہ، H2B یا HMGA1 کا HLA-A سے پابند ہونا HLA-A (تصویر 8A) کے لئے H2B کے اعلی تعلق کو نمایاں کرتا ہے۔
H2B (H2BFS)-HLA-A، HMGA1-HLA-A، اور H2B-HLA-A-HMGA1 کمپلیکس کے درمیان ممکنہ نیٹ ورکس کی تعمیری حرکیات۔(A) بائیں پینل ایک 2D نقشہ ہے (SIM-XL سافٹ ویئر میں تیار کردہ) intramolecular (red) اور intermolecular (blue) crosslinks (crosslink cutoff set to 3.5)۔اس کے علاوہ، شناخت شدہ کراس لنکنگ اوشیشوں کو H2B، HLA-A، اور HMGA1 پروٹین کے ڈھانچے پر لیبل لگایا گیا ہے۔ان پروٹینوں کی متعلقہ شکلیں MOE پیکیج میں لاگو ڈاکنگ پائپ لائن کا استعمال کرتے ہوئے نکالی گئیں۔نچلا بائیں پینل H2B-HLA-A اور HMGA1-HLA-A کمپلیکس کی مختلف پروٹین-پروٹین بائنڈنگ وابستگیوں (GBVI/WSA dG؛ kcal/mol) کی مختلف ممکنہ تبدیلیوں کو دکھاتا ہے۔(B) ہر پروٹین ڈھانچے کے لیے جوہری پوزیشنوں (ہائیڈروجن ایٹموں کو چھوڑ کر) کا معیاری انحراف (RMSD)۔(C) دورانیہ ≥ 10 ns کے مخصوص تعاملات پر غور کرتے ہوئے مختلف نقلی کمپلیکس سے انٹرمولیکیولر پروٹین-پروٹین ہائیڈروجن بانڈ کے تعاملات۔ایچ-بانڈ ڈونر-قبول کرنے والے کٹ آف کا فاصلہ 3.5 Å پر سیٹ کیا گیا تھا، اور ڈونر-H-قبول کنندہ کٹ آف اینگل ≥ 160 °–180 ° پر سیٹ کیا گیا تھا۔(D) لیبل شدہ باقیات جو اپنے متعلقہ شراکت داروں کے ساتھ HLA-A پروٹین-پروٹین کے تعاملات کو تشکیل دیتے ہیں، ≥ 20 ns پر پھیلے ہوئے، ڈمی HLA-A-H2B اور HLA-A-HMGA1 کمپلیکس سے نکالے گئے ہیں۔پروٹین کے ڈھانچے 100 این ایس ایم ڈی ایس کی اوسط ساخت کی نمائندگی کرتے ہیں۔(E) HLA-A-H2B اور HLA-A-HMGA1 کمپلیکس کے درمیان تعاملات دو پیپٹائڈس کے درمیان K یا S تعامل کی سائٹ پر مبنی 100 ns سے زیادہ H2B-HLA تخروپن کے ذریعہ ٹریک کردہ تعاملات کے مقابلے میں۔کمپلیکسز /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1۔کراس لنکس کی تشخیص کے لیے حد کی قیمت 3.0 پر سیٹ کی گئی تھی، اور MDS سے ≥ 10 ns لینے والے مخصوص تعاملات کو مدنظر رکھا گیا تھا۔BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, USA) اور مالیکیولر آپریٹنگ انوائرمنٹ (MOE؛ کیمیکل کمپیوٹنگ گروپ انکارپوریٹڈ، مونٹریال، کیوبیک، کینیڈا) پیکجوں کا استعمال کرتے ہوئے پروٹین کے ڈھانچے کا تصور کیا گیا۔
وقت کے ساتھ HLA-A مالیکیولز کے استحکام (معیاری انحراف؛ RMSD یا معیاری انحراف؛ RMSF) نے اشارہ کیا کہ کمپلیکس میں H2B یا HMGA1 پروٹین کی موجودگی نے HLA-A کو مستحکم کیا (شکل 8B، شکل S5)۔HMGA1 پروٹین HLA-A کی B2M سائٹ سے مضبوطی سے جڑا ہوا ہے، HLA-A-HMGA1 یا H2B-HLA-A-HMGA1 کمپلیکس میں HLA-A امینو ایسڈز کے استحکام کو اکساتا ہے (شکل 8B، شکل S5)۔خاص طور پر، HLA کی باقیات ~60-90 اور ~180-210 H2B (تصویر 8B) کی موجودگی میں کم لچکدار پائی گئیں۔H2B اور HMGA1 نے H2B-HLA-A-HMGA1 کمپلیکس میں HLA-A کو اکیلے H2B یا HMGA1 کے پابند کرنے کے مقابلے میں HLA-A کے ساتھ بہتر پابند دکھایا (شکل 8C، D؛ ٹیبل S5)۔ہائیڈروجن بانڈنگ میں شامل باقیات (MD ماڈلڈ ہائی قبضے ≥ 10 ns) کمپلیکس میں CLMS انٹرایکشن سائٹس (K یا S باقیات) کے ساتھ ملتے ہیں، یہ تجویز کرتے ہیں کہ CLMS کے ذریعہ شناخت کردہ تعاملات بہت قابل اعتماد ہیں۔وشوسنییتا (تصویر 8E)۔CLMS اور MD ماڈلنگ میں، تقریباً 190-210 اور تقریباً 200-220 امینو ایسڈ کے درمیان HLA-A کی باقیات بالترتیب H2B اور HMGA1 کو باندھتے ہوئے پائے گئے (تصویر 8E)۔
پروٹین-پروٹین کے تعاملات متحرک ساختی نیٹ ورکس بناتے ہیں جو بعض محرکات کے جواب میں انٹرا سیلولر مواصلات میں ثالثی کرتے ہیں۔چونکہ بہت سے پروٹومکس نقطہ نظر پروٹین کی مجموعی مستحکم حالت کی سطح میں تبدیلیوں کا پتہ لگاتے ہیں، پروٹین-پروٹین کے تعامل کی حرکیات کو بائنڈنگ انٹرفیس کو حاصل کرنے کے لیے اضافی ٹولز کی ضرورت ہوتی ہے، اور CLMS ایسا ہی ایک ٹول ہے۔انٹرفیرون سگنلنگ سسٹم ایک سائٹوکائن نیٹ ورک ہے جو خلیوں کو ماحولیاتی پیتھوجینک اور اندرونی پیتھولوجیکل سگنلز کی ایک رینج کا جواب دینے کی اجازت دیتا ہے، جس کا نتیجہ انٹرفیرون-انڈیکیبل پروٹین کے ذیلی سیٹوں کی شمولیت پر ہوتا ہے۔ہم نے CLMS کا اطلاق اس بات کا تعین کرنے کے لیے کیا کہ آیا انٹرفیرون سے متاثرہ پروٹین کے پینل کے درمیان ناول پروٹین-پروٹین کے تعاملات کی نشاندہی کی جا سکتی ہے۔پروٹین کمپلیکس پر قبضہ کرنے کے لیے انٹرفیرون ریسپانسیو Flo-1 سیل ماڈل میں گلوبل پروٹین کراس لنکنگ تجزیہ استعمال کیا گیا تھا۔نان کراس لنکڈ اور کراس لنکڈ سیلز سے ٹرپٹک پیپٹائڈس کا اخراج پیپٹائڈ کی گنتی، راستے کی افزودگی، اور پیپٹائڈ کی لمبائی کی متعین LFQ شدت کے ساتھ تقسیم کی اجازت دیتا ہے۔کیننیکل انٹرفیرون-انڈیکیبل پروٹین کی شناخت ایک مثبت اندرونی کنٹرول کے طور پر کی گئی تھی، جبکہ کینونیکل انٹرفیرون-انڈیکیبل پروٹین جیسے MX1، UP18، OAS3 اور STAT1 کے نئے انٹرمولیکولر اور انٹرمولیکولر کراس لنکڈ ایڈکٹ کا مشاہدہ کیا گیا تھا۔فنکشنل علاقوں میں مختلف ساختی خصوصیات اور تعاملات کی چھان بین کی گئی ہے۔
HLA-A، MDN1 اور H2B کے درمیان تعامل کا پتہ Flo-1 اور A549 خلیوں میں امیونوبلوٹنگ کے ذریعے پایا گیا جن کا IFNα کے ساتھ علاج اور علاج نہیں کیا گیا۔ہمارے نتائج نمایاں کرتے ہیں کہ HLA-A IFNα پر منحصر انداز میں H2B کے ساتھ کمپلیکس کرتا ہے۔ہمارا کام ان دونوں کمپلیکس کے مشترکہ لوکلائزیشن کی مزید تلاش کے لیے ایک دلچسپ مقام کی نمائندگی کرتا ہے۔سیل کی قسم کے آزاد انٹرفیرون ثالثی پروٹین کے تعاملات کی شناخت کے لیے سیل لائنوں کے پینل تک CLMS اپروچ کو بڑھانا بھی دلچسپ ہوگا۔آخر میں، ہم نے H2BFS-HLA-A-HMGA1 کمپلیکس میں شامل پروٹینوں کی تعمیری حرکیات کو سمجھنے کے لیے ایک متبادل نقطہ نظر کے طور پر MD ماڈلنگ کا استعمال کیا، جس نے intramolecular اور intermolecular cross-talk کا سراغ لگایا۔CLMS ڈیٹا سے حاصل کردہ نتائج H2BFS، HLA-A، اور HMGA1 پروٹین کی مختلف شکلوں کے امکان کی تجویز کرتے ہیں۔ان ڈاکنگ پروٹین کمپلیکس کے درمیان ممکنہ مختلف تبدیلیوں نے سی ایل ایم ایس ڈیٹاسیٹ میں مشاہدہ کیے گئے متعدد تعاملات کا انکشاف کیا۔ہمارے طریقہ کار کی اہم طاقتوں میں سے ایک یہ ہے کہ یہ HLA جیسے انتہائی پولیمورفک جینز کے باہمی تعامل کی آسانی سے شناخت کی اجازت دیتا ہے، لہذا HLA ہاپلوٹائپ مخصوص پروٹین کے تعامل کا مطالعہ کرنا دلچسپ ہوگا جن کا مطالعہ کرنا بصورت دیگر مشکل ہے۔ایک ساتھ مل کر، ہمارا ڈیٹا یہ ظاہر کرتا ہے کہ CLMS کا استعمال انٹرفیرون سے منسلک سگنلنگ نیٹ ورکس کے بارے میں ہماری سمجھ کو بڑھانے اور ٹیومر مائیکرو ماحولیات میں زیادہ پیچیدہ انٹر سیلولر سسٹمز کا مطالعہ کرنے کی بنیاد فراہم کرنے کے لیے کیا جا سکتا ہے۔
Flo-1 خلیات ATCC سے حاصل کیے گئے تھے اور DMEM (Gibco) میں 1% پینسلن/اسٹریپٹومائسن (انویٹروجن)، 10% فیٹل بوائن سیرم (گبکو) کے ساتھ مل کر برقرار رکھا گیا تھا اور 37°C اور 5% CO2 پر محفوظ کیا گیا تھا۔انکیوبیشنIFNα14 (ایڈنبرا پروٹین پروڈکشن کی سہولت کے ذریعہ تیار کردہ) کے ساتھ علاج کرنے سے پہلے خلیوں کو 70-80٪ سنگم تک بڑھایا گیا تھا۔دیگر تمام کیمیکلز اور ریجنٹس سگما ایلڈرچ سے خریدے گئے تھے جب تک کہ دوسری صورت میں نوٹ نہ کیا جائے۔
Flo-1 خلیات کو 6 کنویں پلیٹوں میں کلچر کیا گیا اور اگلے دن خلیوں کا علاج 10 ng/ml IFNα14 کے ساتھ 24 گھنٹے تک تقریباً 80% سنگم تک کیا گیا۔خلیوں کو پی بی ایس کے ساتھ تین بار دھویا گیا اور پی بی ایس میں تازہ تیار شدہ ڈی ایس ایس (تھرمو فشر سائنٹیفک) (ڈی ایم ایس او میں تحلیل) کے ساتھ 37 ° C پر 5 منٹ کے لئے 0.5 ایم ایم کی حتمی حراستی تک باندھا گیا۔ڈی ایس ایس کراس لنکنگ ری ایکشن کو پی بی ایس سے بدل دیا گیا اور بقایا ڈی ایس ایس کو پی بی ایس میں 20 ایم ایم ٹریس (پی ایچ 8.0) کو 37 ڈگری سینٹی گریڈ پر 15 منٹ کے لیے شامل کرکے بجھایا گیا۔خلیوں کو سکریپنگ کے ذریعہ جمع کیا گیا تھا اور کم بائنڈنگ ٹیوبوں (اکسیجن) میں جمع کیا گیا تھا۔
سیل گولی کو 300 µl یوریا لیسیز بفر (8 M یوریا، 0.1 M Tris، pH 8.5) کے ساتھ کمرے کے درجہ حرارت پر 30 منٹ تک کبھی کبھار ہلنے کے ساتھ لیس کیا گیا تھا۔سینٹرفیوگریشن کے تمام اقدامات 8 ° C پر 14,000 xg پر کئے گئے۔لیزیٹ کو 10 منٹ کے لیے سینٹرفیوج کریں اور سپرنٹنٹ کو نئی ٹیوب میں منتقل کریں۔بقیہ واضح ذرات دوسرے لیسیز بفر کے 150 μl (2 M یوریا، 2% (w/v) SDS (سوڈیم ڈوڈیسائل سلفیٹ)) میں 30 منٹ یا اس سے زیادہ کے لیے تحلیل کیے گئے جب تک کہ ایک یکساں آبی محلول حاصل نہ ہو جائے۔لیسیٹ کو 20 منٹ کے لئے سینٹرفیوج کیا گیا تھا اور سپرنٹنٹ کو پچھلے مرحلے میں حاصل کردہ لائسیٹ کے ساتھ ملا دیا گیا تھا۔مائیکرو پلیٹ کے طریقہ کار کے لیے کارخانہ دار کی ہدایات کے مطابق مائیکرو بی سی اے پرکھ (تھرمو فشر سائنٹیفک) کا استعمال کرتے ہوئے پروٹین کی تعداد کا اندازہ لگایا گیا۔نمونے فوری طور پر مائع نائٹروجن میں منجمد کر دیے گئے اور -80 ° C پر محفوظ کر لیے گئے۔
تقریباً 100 μg گھلنشیل کراس سے منسلک پروٹین کو ایک ترمیم شدہ فلٹریشن سیمپل تیاری پروٹوکول (FASP) کا استعمال کرتے ہوئے پروسیس کیا گیا جیسا کہ Wisniewski et al نے بیان کیا ہے۔69 مختصراً، پروٹین کو 200 µl یوریا بفر (0.1 M Tris میں 8 M یوریا، pH 8.5) کے ساتھ جوڑا جاتا ہے، بھنور اور آدھا کر دیا جاتا ہے۔سینٹرفیوگریشن کے تمام اقدامات 25 ° C پر 14,000 xg پر کیے گئے۔کراس سے منسلک پروٹین لائسیٹ کا پہلا نصف ایک 10 kDa مائیکروکون سینٹری فیوگل فلٹر ڈیوائس میں منتقل کیا گیا تھا جو الٹراسیل-10 جھلی (مرک) سے لیس تھا، اس کے بعد 25 منٹ کے لیے فلٹر پر سینٹرفیوگریشن کیا گیا تھا۔پھر پروٹین کا دوسرا نصف فلٹر میں شامل کریں اور انہی اقدامات کو دہرائیں۔یوریا بفر میں 100 μl 17 mM tris (2-carboxyethyl) فاسفائن ہائیڈروکلورائڈ (TCEP) شامل کرکے پروٹین کی بازیابی کی گئی۔ریکوری کو تھرمو مکسر پر 600 rpm پر 30 منٹ کے لیے 37 ° C پر ہلایا گیا۔اس کے علاوہ، کالم کو سینٹرفیوج کیا گیا تھا اور یوریا بفر میں 100 μl 50 mM iodoacetamide کا استعمال کرتے ہوئے کم کراس سے منسلک پروٹین کو الکلیٹ کیا گیا تھا۔الکیلیشن رد عمل کمرے کے درجہ حرارت پر اندھیرے میں 20 منٹ تک کیا گیا۔کالم کو گھمائیں، کالم کی دیواروں کو 100 µl یوریا بفر سے 3 بار دھوئیں، اور پھر سینٹری فیوج کریں۔ایک ہی آپریشن 3 بار 100 μl 100 mM امونیم بائ کاربونیٹ کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔ٹرپسنائزیشن سے پہلے، کلیکشن ٹیوب کو ایک نئی سے بدل دیں۔ٹرپسن بفر (پرومیگا) میں 50 ایم ایم امونیم بائی کاربونیٹ اور 1 µl ٹرپسن پتلا ہوا ہاضمہ بفر شامل کریں۔ٹرپسن اور پروٹین کا تناسب تقریباً 1:33 پر برقرار رکھا گیا تھا، اور ہضم کے رد عمل کو ایک مرطوب چیمبر میں 37 ° C پر راتوں رات انکیوبیٹ کیا جاتا تھا۔کراس لنکڈ پیپٹائڈ کو 25 منٹ کے لئے سینٹرفیوگریشن کے ذریعہ فلٹر سے خارج کیا گیا تھا۔فلٹر میں 50 μl 0.5 M NaCl شامل کرکے پیپٹائڈ کی بازیابی کو بہتر بنایا گیا، اس کے بعد 25 منٹ کے لیے سینٹرفیوگریشن کی گئی۔
سی 18 مائیکرو اسپن کالم (ہارورڈ اپریٹس) کو بوچل ایٹ ال.70 کے بیان کردہ پروٹوکول کے بعد کراس سے منسلک ٹرپٹک پیپٹائڈس کو صاف کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا جس میں معمولی ترمیم کی گئی تھی۔مختصراً، C18 اسپن کالموں کو acetonitrile (AcN) (Merck) میں 0.1% فارمک ایسڈ (FA) کے تین واش اور 0.1% FA کے دو واشز کے ساتھ چالو کیا گیا۔کالم کو 15 منٹ کے لیے 0.1% FA کے ساتھ ہائیڈریٹ کیا گیا تھا۔نمونوں کو اسپن کالموں میں لوڈ کریں اور 0.1% FA کے ساتھ 3 بار دھوئیں۔ڈیسالٹ شدہ پیپٹائڈس کو 0.1% FA میں 50%، 80% اور 100% AcN کا استعمال کرتے ہوئے مرحلہ وار تدریج کے ساتھ ترتیب وار کیا گیا تھا۔نمونوں کو اسپیڈ ویک پلس کنسنٹریٹر (ایپینڈورف) میں اس وقت تک خشک کیا گیا جب تک کہ بقایا مائع مکمل طور پر غائب نہ ہو جائے۔ایلوٹڈ پیپٹائڈس کو 100 μl 0.08% trifluoroacetic acid میں 2.5% AcN میں تحلیل کیا گیا تھا اور ارتکاز کو NanoDrop 2000 (Thermo Scientific) پر ماپا گیا تھا۔LC-MS/MS سسٹم میں تقریباً 1 μg کراس لنکڈ پیپٹائڈ فی نمونہ لگایا گیا تھا۔
کراس سے منسلک پیپٹائڈس کو الٹی میٹ 3000 RSLCnano LC سسٹم (تھرمو سائنٹیفک) پر الگ کیا گیا تھا جو ایک Orbitrap Exploris 480 ماس اسپیکٹرومیٹر (تھرمو سائنٹیفک) سے منسلک تھا۔کراس سے منسلک پیپٹائڈس کو 300 µm ID پر جمع کیا گیا تھا، 5 ملی میٹر لمبا µ-پری کالم C18 کیپچر کالم C18 PepMap100 sorbent اور 5 µm PepMap sorbent (Thermo Scientific) سے بھرا ہوا تھا۔پمپ فلو سیٹ کو 5 µl/min 0.08% trifluoroacetic acid 2.5% AcN میں تحلیل کریں۔کراس سے منسلک پیپٹائڈس کو ایک تجزیاتی فیوزڈ سلکا کالم پر الگ کیا گیا تھا جس کا اندرونی قطر 75 μm اور لمبائی 150 ملی میٹر تھی، جس میں 2 μm پیپ میپ سوربینٹ (تھرمو سائنٹیفک) سے بھرا ہوا تھا۔موبائل فیز A اور B بالترتیب پانی میں 0.1% FA اور acetonitrile میں 0.1% FA پر مشتمل ہے۔گریڈینٹ 2.5% B سے شروع ہوتا ہے اور 90 منٹ میں 40% B تک بڑھ جاتا ہے، پھر اگلے 2 منٹوں میں 90% B تک بڑھ جاتا ہے۔موبائل فیز کمپوزیشن کو 10 منٹ کے لیے 90% B پر برقرار رکھا گیا اور پھر 2 منٹ میں 2.5% B تک لکیری طور پر کم ہو گیا۔اگلے سائیکل سے 8 منٹ پہلے کالم کو 2.5% B پر متوازن کیا گیا تھا۔تجزیاتی کالم سے نکالے گئے کراس سے منسلک پیپٹائڈس کو نینو الیکٹرو اسپرے آئنائزیشن (NSI) سورس میں آئنائز کیا گیا تھا اور ایکسپلوریس 480 ماس اسپیکٹومیٹر (تھرمو سائنٹیفک) میں انجکشن لگایا گیا تھا۔
Orbitrap Exploris 480 ماس سپیکٹرو میٹر مثبت ڈیٹا کوریلیشن موڈ میں کام کرتا ہے۔ایک مکمل اسکین سیکشن موڈ میں 120,000 کے ریزولوشن میں m/z 350 Th سے m/z 2000 Th تک رینج سیٹنگ کے ساتھ کیا گیا تھا۔50ms کے زیادہ سے زیادہ ان پٹ ٹائم کے ساتھ معمول کے مطابق AGC کا ہدف 300% مقرر کیا گیا تھا۔پیپٹائڈس کے لئے مونوسوٹوپک چوٹی کا پتہ لگانے کو قائم کیا گیا ہے۔محدودیت میں نرمی کا پیرامیٹر درست پر سیٹ کیا جاتا ہے اگر بہت کم پیش رو پائے جاتے ہیں۔پیشگی کی کم از کم آئنک طاقت 5.0e3 پر سیٹ کی گئی تھی اور تجربات میں +8 تک پیشگی چارج ریاستیں شامل تھیں۔
ڈیٹا کوریلیشن موڈ میں بڑے اسکینز کے درمیان سائیکل کا وقت 2.5 سیکنڈز پر سیٹ کیا گیا تھا۔پیشگی آئن کے پہلے ٹکڑے ہونے کے بعد متحرک بڑے پیمانے پر اخراج کو 20 سیکنڈ پر سیٹ کیا گیا تھا۔پیشگی تنہائی ونڈو کو 2th پر سیٹ کیا گیا تھا۔ایک فکسڈ تصادم توانائی کے موڈ کے ساتھ معمول کی تصادم توانائی کی قسم کو ڈیٹا پر منحصر MS/MS اسکین میں منتخب کیا گیا تھا۔تصادم کی توانائی 30% پر سیٹ ہے۔Orbitrap ریزولوشن 15,000 اور AGC کا ہدف 100% مقرر کیا گیا تھا۔حسب ضرورت زیادہ سے زیادہ انجیکشن کا وقت 60 ملی سیکنڈز پر سیٹ کیا گیا ہے۔
کراس لنکڈ نمونوں میں پروٹین-پروٹین نیٹ ورک کا سراغ لگانے سے پہلے، ہم نے خام فائلوں کو میکس کوانٹ پیکیج (ورژن 1.6.12.0) 26,27 کا استعمال کرتے ہوئے پروسیس کیا تاکہ نمونوں میں ٹریس ایبل پیپٹائڈز/پروٹینز کی شناخت کی جا سکے۔اس کے علاوہ، اسی طرح کے پروٹومک تجزیے غیر منسلک Flo-1 نمونوں پر کیے گئے جن کا علاج اور IFNα کے ساتھ علاج نہیں کیا گیا۔MS/MS ڈیٹا کو UniProt انسانی ڈیٹا بیس (www.uniprot.org) میں تلاش کیا گیا (12 اگست 2020 کو اپ لوڈ کیا گیا، 75,093 اندراجات پر مشتمل ہے) بلٹ ان سرچ انجن Andromeda27 کا استعمال کرتے ہوئے۔تلاش ینجائم کی مخصوصیت اور ڈیامیڈیشن (N، Q) اور آکسیڈیشن (M) کی مختلف ترمیمات کی نشاندہی کیے بغیر کی گئی۔پیشگی بڑے پیمانے پر رواداری 20 پی پی ایم اور پروڈکٹ آئنز 0.02 Da پر رکھی گئی تھی۔ابتدائی اور زیادہ سے زیادہ بڑے پیمانے پر انحراف 10 پی پی ایم پر سیٹ کیا گیا تھا۔پیپٹائڈ کی زیادہ سے زیادہ مقدار 4600 Da پر رکھی گئی تھی اور ترتیب کی مماثلت 7 اور 25 امینو ایسڈ (aa) کے درمیان رکھی گئی تھی۔پرسیئس پروگرام (ورژن 1.6.10.45) کا استعمال کرتے ہوئے مزید شماریاتی تجزیہ کیا گیا۔پروٹین کے مواد کا حساب پروٹین کی سپیکٹرل شدت کو معمول پر لا کر لگایا گیا تھا (LFQ شدت؛ بغیر لیبل شدہ مقدار) 27 اور شدت کی اقدار کو لاگ 2 میں تبدیل کر دیا گیا تھا۔پیپٹائڈ کی شدت سے شناخت شدہ پروٹینوں کا ایک درجہ بندی کا جھرمٹ R (v 4.1.2) میں فیٹ میپ (v1.0.12) پیکیج کا استعمال کرتے ہوئے بنایا گیا تھا۔پاتھ وے کی افزودگی کا تجزیہ IFNα سے علاج شدہ پروٹینوں کے لئے رییکٹوم پاتھ وے ڈیٹا بیس کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا جو علاج نہ کیے گئے نمونوں کے مقابلے میں چار گنا سے زیادہ چالو تھے۔
LC-MS/MS کے ذریعے مانیٹر کیے جانے والے پروٹین کمپلیکس کے لائسین (K) یا سیرین (S) مخصوص کیمیائی کراس لنکس کی شناخت کراس لنکڈ پیپٹائڈس (SIM-XL) 29 کے لیے سپیکٹروسکوپک شناختی مشین (SIM-XL) کے ذریعے کی گئی۔سب سے پہلے، انٹرفیرون سے وابستہ (IFN) DNA نقصان مزاحمت کے دستخط (IRDS) جینوں کے درمیان ممکنہ تعاملات کی جانچ پڑتال IRDS پروٹین ڈیٹاسیٹ کا استعمال کرتے ہوئے کی گئی جسے Padariya et al.28 میں بیان کیا گیا ہے۔تمام ہیومن یونی پروٹ کی تمام شرائط اور اعادہ کی اسکریننگ کمپیوٹیشنل طور پر بہت زیادہ ہے، اس لیے پورا ہیومن یونی پروٹ ڈیٹا بیس (www.uniprot.org) (12 اگست 2020 کو ڈاؤن لوڈ کیا گیا، 75,093 اندراجات پر مشتمل ہے) IFNα سے علاج شدہ تکرار کے خلاف۔اعلی اعتماد کے تعاملات کے فلٹرز میں سے ایک۔حاصل کردہ ان اعلیٰ اہمیت کے تعاملات کو تمام تکرار اور حالات میں توسیع اور جانچ کی گئی۔
SIM-XL میں، DSS کو کراس لنکر (XL) کے لیے استعمال کیا گیا تھا اور XL ویٹ شفٹ اور ترمیم ویٹ شفٹ کو بالترتیب 138.06 اور 156.07 پر سیٹ کیا گیا تھا۔درج ذیل کراس لنکنگ ری ایکشن سائٹس پر غور کیا جاتا ہے: KK، KS اور KN-TERM، بغیر رپورٹر آئنوں کے۔پیشگی اور ٹکڑے دونوں پی پی ایم کو 20 پر سیٹ کیا گیا تھا اور Xrea کی حد 0.15 پر سیٹ کی گئی تھی۔ٹرپسن کو مکمل طور پر مخصوص سمجھا جاتا تھا، اور ایک ہائی انرجی سی-ٹریپ (HCD) فریگمنٹیشن کا طریقہ نافذ کیا گیا تھا۔XCorr متحرک DB کمی کی حد اور متحرک DB میں کمی کے لیے پیپٹائڈس کی کم از کم تعداد بالترتیب 2.5 اور 2 پر سیٹ کی گئی تھی۔دیگر پیرامیٹرز ہیں: مونوسوٹوپ کا امکان اور چوٹی اتفاقی کٹ آف، کم از کم 4 AA باقیات فی اسٹرینڈ اور زیادہ سے زیادہ اسٹرینڈ چارج، اور مسڈ اسپلٹس کی 3 میکسما۔نتیجے میں سلے ہوئے 2D نقشوں کا تجزیہ (SIM-XL) میں کیا گیا اور xQuest28 گرافیکل نمائندگی کو 2D نقشے بنانے کے لیے استعمال کیا گیا۔پروٹین ڈھانچے پر پروٹین کراس لنکس PyMol (PyMOL مالیکیولر گرافکس سسٹم، ورژن 2.0 Schrödinger, LLC) میں فراہم کیے گئے ہیں۔
پروٹین ماڈل کے ڈھانچے کو Phyre2 سرور (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) 11 کا استعمال کرتے ہوئے ہومولوجی ماڈلنگ کے اصولوں کا استعمال کرتے ہوئے اور "پوشیدہ مارکوف طریقہ" پر عمل درآمد کیا گیا تھا۔Phyre2 معروف پروٹین ڈھانچے کے ساتھ ترتیب کی سیدھ پر مبنی ماڈل ڈھانچے تیار کرتا ہے۔H2BFS، HLA-A، HMGA1، LRCH4، اور MDN1 پروٹینز کے لیے، ٹیمپلیٹ ڈھانچے 1kx552، 1kj349، 2eze55، 6hlu62، اور 6i2665 استعمال کیے گئے تھے۔اس کے علاوہ AlphaFold71 MX1، UBP18 اور ROBO1 کی ساخت پر بھی غور کیا گیا۔پروٹین کا ڈھانچہ BIOVIA Discovery Studio Visualizer پیکیج (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, USA) اور مالیکیولر آپریٹنگ انوائرمنٹ پیکج (MOE؛ کیمیکل کمپیوٹنگ گروپ انکارپوریٹڈ، مونٹریال، کیوبیک، کینیڈا) کا استعمال کرتے ہوئے تصور کیا گیا تھا۔