347 12.7*1.24 ملی میٹر سٹینلیس سٹیل کوائلڈ نلیاں، سنکرونس الیکٹرو سٹیٹک کنڈینسیشن کا مالیکیولر میکانزم اور α-synuclein اور tau کی جمع

Nature.com پر جانے کا شکریہ۔آپ محدود سی ایس ایس سپورٹ کے ساتھ براؤزر کا ورژن استعمال کر رہے ہیں۔بہترین تجربے کے لیے، ہم تجویز کرتے ہیں کہ آپ ایک اپ ڈیٹ شدہ براؤزر استعمال کریں (یا انٹرنیٹ ایکسپلورر میں مطابقت موڈ کو غیر فعال کریں)۔اس کے علاوہ، جاری تعاون کو یقینی بنانے کے لیے، ہم سائٹ کو بغیر اسٹائل اور جاوا اسکرپٹ کے دکھاتے ہیں۔
سلائیڈرز فی سلائیڈ تین مضامین دکھا رہے ہیں۔سلائیڈوں کے ذریعے جانے کے لیے پیچھے اور اگلے بٹنوں کا استعمال کریں، یا ہر سلائیڈ سے گزرنے کے لیے آخر میں سلائیڈ کنٹرولر بٹن استعمال کریں۔

347 سٹینلیس سٹیل پائپ تفصیلات

347 12.7*1.24mm سٹینلیس سٹیل کوائلڈ نلیاں

بیرونی قطر: 6.00 ملی میٹر OD 914.4 mm OD تک، سائز 24 انچ تک NB دستیاب سابق اسٹاک، OD سائز اسٹیل ٹیوبز دستیاب سابق اسٹاک

SS 347 پائپ کی موٹائی کی حد: 0.3 ملی میٹر - 50 ملی میٹر، SCH 5، SCH10، SCH 40، SCH 80، SCH 80S، SCH 160، SCH XXS، SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, وغیرہ (0.5-12mm) یا ضرورت کے مطابق غیر باقاعدہ سائز

قسم: SS 347 سیملیس پائپس |SS 347 ERW پائپس |SS 347 ویلڈڈ پائپ |SS 347 من گھڑت پائپس |SS 347 CDW نلیاں، LSAW پائپس / سیون ویلڈیڈ / دوبارہ کھینچی گئی

فارم: SS 347 راؤنڈ پائپس/ نلیاں، SS 347 مربع پائپ/ نلیاں، SS 347 مستطیل پائپ/ نلیاں، SS 347 کوائلڈ ٹیوبیں، SS 347 "U" شکل، SS 347 پین کیک کوائل، SS 347 Hydra

لمبائی: سنگل رینڈم، ڈبل رینڈم اور مطلوبہ لمبائی کا اختتام: سادہ اینڈ، بیولڈ اینڈ، ٹریڈڈ

اختتامی تحفظ: پلاسٹک کیپس |باہر ختم: 2B، نمبر 4، نمبر 1، نمبر 8 سٹینلیس سٹیل کے پائپوں کے لیے آئینہ ختم، کسٹمر کی ضروریات کے مطابق ختم

ترسیل کی حالت: اینیلڈ اور اچار، پالش، چمکدار اینیلڈ، کولڈ ڈرا

معائنہ، ٹیسٹ رپورٹس: مل ٹیسٹ سرٹیفکیٹس، EN 10204 3.1، کیمیکل رپورٹس، مکینیکل رپورٹس، PMI ٹیسٹ رپورٹس، بصری معائنہ رپورٹس، تھرڈ پارٹی انسپکشن رپورٹس، NABL منظور شدہ لیب رپورٹس، تباہ کن ٹیسٹ رپورٹ، غیر تباہ کن ٹیسٹ رپورٹس

پیکنگ: لکڑی کے ڈبوں میں پیک، پلاسٹک کے تھیلے، سٹیل کی پٹیاں بنڈل، یا صارفین کی درخواستوں کے مطابق

خصوصی: اوپر کے علاوہ سائز اور وضاحتیں درخواست پر تیار کی جا سکتی ہیں۔

SS 347 پائپ سائز کی حد: 1/2 انچ NB، OD سے 24 انچ

ASTM A312 347: ہموار اور سیدھے سیون ویلڈڈ آسٹینیٹک پائپ جس کا مقصد اعلی درجہ حرارت اور عام سنکنرن خدمت ہے۔ویلڈنگ کے دوران فلر میٹل کی اجازت نہیں ہے۔

ASTM A358 347: سنکنرن اور/یا اعلی درجہ حرارت کی خدمت کے لیے الیکٹرک فیوژن ویلڈیڈ آسٹینیٹک پائپ۔عام طور پر اس تصریح کے لیے صرف 8 انچ تک کا پائپ تیار کیا جاتا ہے۔ویلڈنگ کے دوران فلر میٹل کو شامل کرنے کی اجازت ہے۔

ASTM A790 347: سیملیس اور سیدھی سیون ویلڈیڈ فیریٹک/آسٹینیٹک (ڈوپلیکس) پائپ جس کا مقصد عام سنکنرن خدمت کے لیے ہے، خاص طور پر تناؤ کے کریکنگ کے خلاف مزاحمت پر زور دیا جاتا ہے۔

ASTM A409 347: سیدھی سیون یا سرپل سیون الیکٹرک فیوژن ویلڈڈ بڑے قطر کے آسٹینیٹک لائٹ وال پائپ 14” سے 30” سائز میں دیواروں Sch5S اور Sch 10S کے ساتھ سنکنرن اور/یا اعلی

ASTM A376 347: اعلی درجہ حرارت کی ایپلی کیشنز کے لیے سیملیس آسٹینیٹک پائپ۔

ASTM A813 347: اعلی درجہ حرارت اور عام سنکنرن ایپلی کیشنز کے لیے سنگل سیون، سنگل یا ڈبل ​​ویلڈڈ آسٹینیٹک پائپ۔

ASTM A814 347: اعلی درجہ حرارت اور عام corrosive سروس کے لیے کولڈ ورک ویلڈڈ آسٹینیٹک پائپ۔

347H سٹینلیس سٹیل پائپس کیمیکل کمپوزیشن

سٹینلیس سٹیل 347H پائپ مکینیکل پراپرٹیز

سٹینلیس سٹیل 347H پائپس فزیکل پراپرٹیز

347H سٹینلیس سٹیل پائپ کے لیے مساوی درجات

Amyloid alpha-synuclein (αS) کی جمع پارکنسنز کی بیماری اور دیگر synucleinopathies کی ایک پہچان ہے۔حال ہی میں، الزائمر کی بیماری کے ساتھ عام طور پر منسلک ٹاؤ پروٹین αS پیتھالوجی سے منسلک کیا گیا ہے اور αS سے بھرپور شمولیتوں میں مشترکہ طور پر پایا گیا ہے، حالانکہ دونوں پروٹینوں کے جمع ہونے کا مالیکیولر میکانزم ابھی تک واضح نہیں ہے۔ہم یہاں رپورٹ کرتے ہیں کہ αS مرحلہ الیکٹرو اسٹیٹک کمپلیکس سنڈینسیشن کے ذریعے مائع کنڈینسیٹس میں الگ ہو جاتا ہے جس میں مثبت چارج شدہ پولی پیپٹائڈس جیسے تاؤ۔پولی کیشنز کے لیے αS کی وابستگی اور کوایگولیشن نیٹ ورک کے والنس کی کمی کی شرح پر منحصر ہے، جمنے تیزی سے جیلیشن یا ہم آہنگی سے گزرتے ہیں جس کے بعد آہستہ امائلائڈ جمع ہوتا ہے۔اعلی درجے کی بایو فزیکل تکنیکوں کے مجموعہ کو یکجا کرکے، ہم مائع-مائع αS/Tau مرحلے کی علیحدگی کو نمایاں کرنے اور ان اہم عوامل کی نشاندہی کرنے میں کامیاب ہوئے جو مائع پروٹین کنڈینسیٹ میں دونوں پروٹینوں پر مشتمل متضاد مجموعوں کی تشکیل کا باعث بنتے ہیں۔
جھلیوں کے حصوں کے علاوہ، خلیات میں مقامی علیحدگی پروٹین سے بھرپور، مائع نما گھنے جسموں کی تشکیل سے بھی حاصل کی جا سکتی ہے جسے بائیو مالیکولر کنڈینسیٹس یا بوندیں کہتے ہیں، ایک عمل کے ذریعے جسے مائع-مائع فیز سیپریشن (LLPS) کہا جاتا ہے۔یہ بوندیں کثیر الجہتی دنیاوی تعاملات سے بنتی ہیں، عام طور پر پروٹین یا پروٹین اور آر این اے کے درمیان، اور تقریباً تمام نظامِ حیات میں مختلف کام انجام دیتی ہیں۔ایل ایل پی کے قابل پروٹینوں کی ایک بڑی تعداد کم پیچیدگی کے سلسلے کی نمائش کرتی ہے جو فطرت میں اور بائیو مالیکیولر کنڈینسیٹس 3,4,5 کی تشکیل میں انتہائی بے ترتیب ہیں۔متعدد تجرباتی مطالعات نے ان پروٹینوں کی لچکدار، اکثر بے ترتیب، اور کثیر الجہتی نوعیت کا انکشاف کیا ہے جو ان مائع نما کنڈینسیٹس کو بناتے ہیں، حالانکہ ان مخصوص مالیکیولر ڈیٹرمینٹس کے بارے میں بہت کم معلوم ہے جو ان کنڈینسیٹس کی نشوونما اور پختگی کو زیادہ ٹھوس شکل تک کنٹرول کرتے ہیں۔ حالت..
نئے اعداد و شمار اس مفروضے کی تائید کرتے ہیں کہ غیر معمولی پروٹین سے چلنے والے ایل ایل پی ایس اور بوندوں کو ٹھوس ڈھانچے میں تبدیل کرنا متعلقہ سیلولر راستے ہو سکتے ہیں جو ناقابل حل زہریلے مجموعوں کی تشکیل کا باعث بنتے ہیں جو اکثر انحطاطی بیماریوں کی علامت ہوتے ہیں۔بہت سے LLPS سے وابستہ اندرونی طور پر ڈس آرڈرڈ پروٹینز (IDPs)، جو اکثر بہت زیادہ چارج شدہ اور لچکدار ہوتے ہیں، طویل عرصے سے ایمیلائڈ ایگریگیشن کے عمل کے ذریعے نیوروڈیجنریشن سے وابستہ ہیں۔خاص طور پر، FUS7 یا TDP-438 جیسے بائیو مالیکولر آئی ڈی پی کنڈینسیٹس یا بڑے کم پیچیدگی والے ڈومینز جیسے کہ hnRNPA19 والے پروٹین کو فلوائزیشن نامی عمل کے ذریعے جیل کی طرح یا ٹھوس شکلوں میں بھی دکھایا گیا ہے۔مرکبٹھوس مرحلے کی منتقلی (LSPT) میں وقت کے ایک فنکشن کے طور پر یا ترجمہ کے بعد کی کچھ تبدیلیوں یا پیتھولوجیکل طور پر اہم تغیرات کے جواب میں 1,7۔
Vivo میں LLPS کے ساتھ منسلک ایک اور IDP Tau ہے، ایک مائکروٹوبول سے وابستہ ڈس آرڈرڈ پروٹین جس کا امائلائڈ ایگریگیشن الزائمر کی بیماری میں ملوث ہے 10 لیکن حال ہی میں پارکنسنز کی بیماری (PD) اور دیگر Synaptic جوہری پروٹینوپیتھیز 11، 12، 13 میں بھی ملوث ہیں۔تاؤ کو سازگار الیکٹرو اسٹاٹک تعاملات کی وجہ سے محلول/سائٹوپلازم سے بے ساختہ الگ ہوتے دکھایا گیا ہے، جس کے نتیجے میں تاؤ سے افزودہ بوندیں بنتی ہیں جنہیں الیکٹرو سٹیٹک کوسرویٹس کہا جاتا ہے۔یہ بھی دیکھا گیا ہے کہ اس قسم کا غیر مخصوص تعامل فطرت میں بہت سے بائیو مالیکولر کنڈینسیٹس کے پیچھے محرک قوت ہے۔تاؤ پروٹین کی صورت میں، الیکٹرو اسٹیٹک ایگریگیشن سادہ ایگریگیشن سے بن سکتی ہے، جس میں پروٹین کے مخالف چارج والے علاقے کلیویج کے عمل کو متحرک کرتے ہیں، یا RNA جیسے منفی چارج شدہ پولیمر کے ساتھ تعامل کے ذریعے پیچیدہ جمع کے ذریعے۔
حال ہی میں، α-synuclein (αS)، PD اور دیگر neurodegenerative بیماریوں میں ملوث ایک amyloid IDP جسے اجتماعی طور پر synucleinopathy17,18 کہا جاتا ہے، سیلولر اور جانوروں کے ماڈلز میں ظاہر کیا گیا ہے 19,20 پروٹین کنڈینسیٹس میں مائع نما رویے کے ساتھ۔ان وٹرو مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ αS بنیادی طور پر ہائیڈروفوبک تعاملات کے ذریعے سادہ جمع کے ذریعے ایل ایل پی ایس سے گزرتا ہے، حالانکہ اس عمل کے لیے غیر معمولی طور پر اعلی پروٹین کی تعداد اور غیر معمولی طور پر طویل انکیوبیشن اوقات کی ضرورت ہوتی ہے 19,21۔آیا Vivo میں مشاہدہ کردہ αS پر مشتمل کنڈینسیٹس اس یا دیگر LLPS کے عمل سے بنتے ہیں یہ ایک اہم حل طلب مسئلہ بنی ہوئی ہے۔اسی طرح، اگرچہ PD اور دیگر synucleinopathies کے نیورانوں میں αS amyloid مجموعے کا مشاہدہ کیا گیا ہے، لیکن صحیح طریقہ کار جس کے ذریعے αS انٹرا سیلولر امائلائڈ جمع کرتا ہے، غیر واضح ہے، کیونکہ اس پروٹین کا زیادہ اظہار خود سے اس عمل کو متحرک نہیں کرتا ہے۔اضافی سیلولر نقصان کی اکثر ضرورت ہوتی ہے، یہ تجویز کرتا ہے کہ انٹرا سیلولر αS امیلائڈ اسمبلیوں کی تجدید کے لئے کچھ سیلولر مقامات یا مائکرو ماحولیات کی ضرورت ہے۔ایک سیلولر ماحول جو خاص طور پر جمع ہونے کا شکار ہے وہ پروٹین کنڈینسیٹس 23 کا اندرونی حصہ ہو سکتا ہے۔
دلچسپ بات یہ ہے کہ αS اور tau کو پارکنسنز کی بیماری اور دیگر synucleinopathies 24,25 کے ساتھ انسانوں میں خصوصیت کی بیماریوں کی شمولیت میں مشترکہ طور پر پایا گیا ہے اور تجربات نے دو پروٹین 26,27 کے درمیان ایک ہم آہنگی پیتھولوجیکل تعلق کی اطلاع دی ہے جو کہ مجموعی αS اور کے درمیان ممکنہ تعلق کی تجویز کرتا ہے۔ neurodegenerative بیماریوں میں tau.بیماری.αS اور tau کو وٹرو اور Vivo 28,29 میں ایک دوسرے کے جمع ہونے اور فروغ دینے کے لیے پایا گیا ہے اور ان دو پروٹینوں پر مشتمل متفاوت مجموعے synucleinopathies 30 کے مریضوں کے دماغ میں دیکھے گئے ہیں۔تاہم، αS اور tau کے درمیان تعامل کی سالماتی بنیاد اور اس کے شریک جمع کے طریقہ کار کے بارے میں بہت کم معلوم ہے۔αS کو αS کے انتہائی منفی چارج شدہ C-ٹرمینل خطے اور تاؤ کے مرکزی پرولین سے بھرپور خطے کے درمیان الیکٹرو سٹیٹک کشش کے ذریعے تاؤ کے ساتھ تعامل کرنے کی اطلاع دی گئی ہے، جو مثبت چارج شدہ اوشیشوں میں بھی افزودہ ہے۔
اس مطالعے میں، ہم یہ ظاہر کرتے ہیں کہ αS واقعی ٹاؤ پروٹین کی موجودگی میں الیکٹرو اسٹیٹک کمپلیکس کنڈینسیشن کے ذریعے بوندوں میں الگ ہو سکتا ہے، اس کے دیگر مثبت چارج شدہ پولی پیپٹائڈس جیسے پولی-L-lysine (pLK) کے ساتھ تعامل کے برعکس، اور اس عمل میں۔αS ڈراپلیٹ نیٹ ورک کے لیے ایک سکیفولڈ مالیکیول کے طور پر کام کرتا ہے۔ہم نے الیکٹرو اسٹاٹک αS coacervates کی پختگی کے عمل میں نمایاں فرق کی نشاندہی کی ہے، جو coacervate نیٹ ورک میں شامل پروٹینوں کے تعامل کی توازن اور طاقت میں فرق سے وابستہ ہیں۔دلچسپ بات یہ ہے کہ، ہم نے طویل عرصے تک رہنے والے مائع کوسرویٹس میں αS اور tau amyloid پروٹین کی مشترکہ جمع کا مشاہدہ کیا اور کچھ اہم عوامل کی نشاندہی کی جو اس طرح کے coacervates میں ان دونوں پروٹینوں کی مشترکہ جمع کا باعث بنتے ہیں۔یہاں ہم اس عمل کو تفصیل سے بیان کرتے ہیں، جو کہ ایک ممکنہ مالیکیولر میکانزم ہے جو بیماری سے متعلق مخصوص شمولیتوں میں دو پروٹینوں کے اجتماعی عمل کا حامل ہے۔
αS کی غیر جانبدار pH (تصویر 1a) پر ایک انتہائی anionic C-ٹرمینل دم ہے، اور ہم نے قیاس کیا کہ یہ پولی کیشنک ڈس آرڈرڈ پولی پیپٹائڈ مالیکیولز کے ساتھ الیکٹرو اسٹیٹک کمپلیکس کے گاڑھا ہونے کے ذریعے LLPS سے گزر سکتا ہے۔ہم نے ابتدائی ماڈل مالیکیول کے طور پر 100-ریزیڈیو پولی-ایل-لائسین (pLK) کو غیر جانبدار pH 32 پر مثبت طور پر چارج شدہ اور بے ترتیب پولیمیرک نوعیت کی وجہ سے استعمال کیا۔ (شکل 1b) بڑھتے ہوئے αS:pLK داڑھ کے تناسب کی موجودگی میں 13C/15N لیبل والے αS کا استعمال۔αS کے Ct-domain کے ساتھ pLK کا تعامل خود کو کیمیائی تبدیلی کی خرابی اور پروٹین کے اس خطے میں چوٹی کی شدت میں کمی سے ظاہر ہوتا ہے۔دلچسپ بات یہ ہے کہ جب ہم نے αS کو تقریباً αS حراستی میں pLK کے ساتھ ملایا۔پولی تھیلین گلائکول (5–15% PEG-8) کی موجودگی میں 5–25 µM (عام LLPS بفر: 10 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) ہم فوری طور پر پروٹین کی تشکیل کے وسیع میدان سے گزرے۔ .فلوروسینس (WF) اور برائٹ فیلڈ (BF) مائکروسکوپی (تصویر 1c) کا استعمال کرتے ہوئے بوندوں کا مشاہدہ کیا گیا۔1-5 µm بوندوں میں مرتکز αS (شامل کیا گیا 1 µM AlexaFluor488-لیبل والا αS, AF488-αS)، ان کی الیکٹرو اسٹاٹک خصوصیات ان کی مزاحمت سے 10% 1,6-hexanediol (1,6-HD) اور اس کی حساسیت سے اخذ کی جا سکتی ہیں۔ NaCl کی حراستی میں اضافہ (تصویر 1c)۔αS/pLK الیکٹرو سٹیٹک کمپلیکس کے coacervates کی سیال جیسی نوعیت ان کی ملی سیکنڈ میں فیوز ہونے کی صلاحیت سے ظاہر ہوتی ہے (تصویر 1d)۔ٹربیڈیمیٹری کا استعمال کرتے ہوئے، ہم نے ان حالات کے تحت بوندوں کی تشکیل کی مقدار درست کی، اس کے استحکام (تصویر 1e) سے منسلک مرکزی تعامل کی الیکٹرو اسٹاٹک نوعیت کی تصدیق کی، اور ایل ایل پی ایس کے عمل پر مختلف پولیمر تناسب کے اثر کا جائزہ لیا (تصویر 1f)۔اگرچہ بوندوں کی تشکیل پولیمر تناسب کی ایک وسیع رینج پر دیکھی جاتی ہے، لیکن یہ عمل بہت سازگار ہوتا ہے جب pLK αS سے زیادہ ہو۔ایل ایل پی کو کیمیاوی طور پر مختلف ڈسپلیسنگ ایجنٹ ڈیکسٹران-70 (70 kDa) کا استعمال کرتے ہوئے یا مختلف نمونوں کے فارمیٹس کا استعمال کرتے ہوئے بھی دیکھا گیا ہے، بشمول گلاس سلائیڈ ڈراپس، مختلف مواد کے مائکروپلیٹ ویلز، ایپنڈورف یا کوارٹز کیپلیریاں۔
اس مطالعے میں استعمال ہونے والے WT-αS اور ΔCt-αS کی مختلف حالتوں میں مختلف پروٹین خطوں کی منصوبہ بندی کی نمائندگی۔ایمفیپیتھک این ٹرمینل ڈومین، ہائیڈروفوبک امائلائیڈ فارمنگ (این اے سی) ریجن، اور منفی چارج شدہ سی ٹرمینل ڈومین بالترتیب نیلے، نارنجی اور سرخ رنگ میں دکھائے گئے ہیں۔WT-αS کا نیٹ چارج فی بقایا (NCPR) نقشہ دکھایا گیا ہے۔b macromolecular clumps کی غیر موجودگی میں αS/pLK تعامل کا NMR تجزیہ۔جیسے جیسے pLK کا ارتکاز بڑھتا ہے (αS:pLK داڑھ کا تناسب 1:0.5، 1:1.5، اور 1:10 بالترتیب ہلکے سبز، سبز اور گہرے سبز میں دکھایا جاتا ہے)۔c Coacervate αS/pLK (مولر ریشو 1:10) 25 µM پر (1 µM AF488 لیبل والا αS یا Atto647N- لیبل والا pLK for WF امیجنگ) LLPS بفر (اوپر) میں یا 500 mMtobot کے ساتھ ضمیمہ (اوپر) % 1,6-hexanediol (1,6-HD؛ نیچے دائیں)۔اسکیل بار = 20 µm۔d 25 μM کے ارتکاز میں αS/pLK (مولر ریشو 1:10) کے BF ڈراپلیٹ فیوژن کی نمائندہ مائکروسکوپک تصاویر؛تیر انفرادی قطروں (سرخ اور پیلے رنگ کے تیر) کے 200 ms کے اندر ایک نئے قطرے (نارنجی تیر) میں ضم ہونے کی نشاندہی کرتے ہیں)۔اسکیل بار = 20 µm۔25 µM αS پر 500 mM NaCl یا 10% 1,6-HD کے اضافے سے پہلے اور بعد میں ایل ایل پی ایس بفر میں ہلکا بکھرنا (350 nm پر) αS/pLK جمع (N = 3 نمونے کی نقل، اوسط اور معیاری انحراف بھی اشارہ کیا گیا ہے)۔f BF امیج (اوپر) اور 25 μM αS پر αS/pLK جمع کا ہلکا بکھرنے والا تجزیہ (350 nm پر، نیچے) بڑھتا ہوا αS:pLK داڑھ تناسب (N = 3 نمونہ نقل، اوسط اور معیاری انحراف بھی اشارہ کیا گیا ہے)۔اسکیل بار = 10 µm۔ایک تصویر پر اسکیل بار ایک پینل میں موجود تمام امیجز کے پیمانے کی نشاندہی کرتا ہے۔خام ڈیٹا خام ڈیٹا فائلوں کی شکل میں فراہم کیا جاتا ہے۔
tau31 کے ساتھ براہ راست تعامل کے ذریعے αS/pLK الیکٹرو اسٹیٹک کمپلیکس کنڈینسیشن اور αS کے کلائنٹ مالیکیول کے طور پر tau/RNA کنڈینسیٹ کے ہمارے مشاہدات کی بنیاد پر، ہم نے یہ قیاس کیا کہ αS اور tau RNA کی عدم موجودگی میں سالوینٹ کے ساتھ باہم الگ ہو سکتے ہیں۔ گاڑھا ہوناالیکٹرو سٹیٹک کمپلیکس کے ذریعے، اور αS αS/Tau coacervates میں سکیفولڈ پروٹین ہے (شکل 2e میں تاؤ چارج کی تقسیم دیکھیں)۔ہم نے مشاہدہ کیا کہ جب 10 μM αS اور 10 μM Tau441 (بالترتیب 1 μM AF488-αS اور 1 μM Atto647N-Tau پر مشتمل ہے) کو LLPS بفر میں ملایا گیا، تو انہوں نے آسانی سے دونوں پروٹینوں پر مشتمل پروٹین کے مجموعے بنائے، جیسا کہ WF مائکروسکوپی نے دیکھا ہے۔(تصویر 2a)۔بوندوں میں دو پروٹینوں کے اجتماعی ہونے کی تصدیق کنفوکل (سی ایف) مائکروسکوپی (ضمیمہ تصویر 1 اے) سے ہوئی۔اسی طرح کے رویے کا مشاہدہ کیا گیا جب dextran-70 کو جمع کرنے والے ایجنٹ کے طور پر استعمال کیا گیا تھا (ضمنی شکل 1c)۔یا تو FITC کے لیبل والے PEG یا dextran کا استعمال کرتے ہوئے، ہم نے پایا کہ دونوں کراؤڈنگ ایجنٹس کو یکساں طور پر نمونوں میں تقسیم کیا گیا تھا، جس میں نہ تو علیحدگی دکھائی دیتی ہے اور نہ ہی ایسوسی ایشن (ضمنی شکل 1d)۔بلکہ، یہ تجویز کرتا ہے کہ اس نظام میں وہ میکرو مالیکولر کراؤڈنگ اثرات کے ذریعے مرحلے کی علیحدگی کو فروغ دیتے ہیں، کیونکہ PEG ترجیحی طور پر مستحکم کراؤڈنگ ایجنٹ ہے، جیسا کہ دوسرے LLP سسٹمز 33,34 میں دیکھا گیا ہے۔پروٹین سے بھرپور یہ بوندیں NaCl (1 M) کے لیے حساس تھیں لیکن 1,6-HD (10% v/v) کے لیے نہیں، ان کی الیکٹرو سٹیٹک خصوصیات کی تصدیق کرتی ہیں (ضمیمہ تصویر 2a، b)۔BF مائیکروسکوپی (تصویر 2b) کا استعمال کرتے ہوئے ملی سیکنڈ کے ضم ہونے والے قطروں کے واقعات کو دیکھ کر ان کے سیال رویے کی تصدیق ہوئی۔
ایل ایل پی ایس بفر میں αS/Tau441 کی ایک کنفوکل (CF) مائیکروسکوپی تصاویر (ہر پروٹین کا 10 μM، AF488 کا 0.5 μM لیبل والا αS اور Atto647N لیبل والا Tau441)۔b نمائندہ تفریق مداخلت کنٹراسٹ (DIC) αS/Tau441 ڈراپلیٹ فیوژن ایونٹس کی تصاویر (ہر پروٹین کے لئے 10 μM)۔50 µM αS کی غیر موجودگی (بائیں) یا موجودگی (دائیں) میں Tau441 LLPS (0–15 µM) کی روشنی بکھرنے (350 nm پر) پر مبنی فیز ڈایاگرام۔گرم رنگ زیادہ بکھرنے کی نشاندہی کرتے ہیں۔d αS/Tau441 LLPS نمونوں کا ہلکا بکھرنا αS حراستی میں اضافہ (Tau441 at 5 µM، N = 2–3 نمونے کی تکرار جیسا کہ اشارہ کیا گیا ہے)۔e کچھ تاؤ پروٹین کی مختلف حالتوں اور اس مطالعہ میں استعمال ہونے والے پروٹین کے مختلف خطوں کی منصوبہ بندی کی نمائندگی: منفی طور پر چارج شدہ N-ٹرمینل ڈومین (سرخ)، پرولین سے بھرپور خطہ (نیلا)، مائکروٹوبول بائنڈنگ ڈومین (MTBD، نارنجی میں نمایاں کیا گیا)، اور amyloid تشکیل دینے والی جوڑی سرپل.MTBD (گرے) کے اندر واقع فلیمینٹ ریجنز (PHF)۔Tau441 کا نیٹ چارج فی ریزیڈیو (NCPR) نقشہ دکھایا گیا ہے۔f 1 µM AF488 لیبل والے αS اور Atto647N- لیبل والے ΔNt- کا استعمال کرتے ہوئے، ΔNt-Tau کی موجودگی میں 1 µM AF488-لیبل والے αS یا ΔCt-αS کا استعمال کرتے ہوئے (اوپر، 10 µM فی پروٹین) یا K18 (فی µM µM فی پروٹین) ) ) ) LLPS یا K18 بفر میں گاڑھا WF کے مائکرو گراف۔ایک تصویر میں اسکیل بارز ایک پینل میں تمام امیجز کے پیمانے کی نمائندگی کرتے ہیں (پینلز a، b اور f کے لیے 20 µm)۔پینلز سی اور ڈی کے لیے خام ڈیٹا خام ڈیٹا فائلوں کے طور پر فراہم کیا جاتا ہے۔
اس LLPS عمل میں αS کے کردار کو جانچنے کے لیے، ہم نے سب سے پہلے NaCl (تصویر 2c) کی بڑھتی ہوئی تعداد کا استعمال کرتے ہوئے نیفیلومیٹری کے ذریعے قطرہ قطرہ کے استحکام پر αS کے اثر کی چھان بین کی۔αS پر مشتمل نمونوں میں نمک کا ارتکاز جتنا زیادہ ہوگا، روشنی بکھرنے والی قدریں اتنی ہی زیادہ ہوں گی (350 nm پر)، جو اس LLPS سسٹم میں αS کے مستحکم کردار کی نشاندہی کرتی ہے۔اسی طرح کا اثر αS حراستی (اور اس وجہ سے αS:Tau441 تناسب) کو تقریباً بڑھا کر دیکھا جا سکتا ہے۔تاؤ ارتکاز (5 µM) (تصویر 2d) کے مقابلہ میں 10 گنا اضافہ۔یہ ظاہر کرنے کے لیے کہ αS coacervates میں ایک سکیفولڈ پروٹین ہے، ہم نے LLPS میں خلل ڈالنے والے Tau mutant کے رویے کی چھان بین کرنے کا فیصلہ کیا، جس میں منفی چارج شدہ N-ٹرمینل ریجن (اوشیشوں 1–150، تصویر 2e دیکھیں) کی کمی ہے جسے ΔNt-Tau کہتے ہیں۔WF مائیکروسکوپی اور نیفیلومیٹری نے تصدیق کی کہ ΔNt-Tau خود LLPS (تصویر 2f اور ضمنی شکل 2d) سے نہیں گزرا، جیسا کہ پہلے 14 رپورٹ کیا گیا تھا۔ اسی طرح کے حالات اور پروٹین کے ارتکاز کے تحت Tau اور αS کے فل سائز سلوشنز کے قطروں کی کثافت کے قریب قطرہ قطرہ کے ساتھ بحال کیا جاتا ہے۔اس عمل کو کم میکرو مالیکولر ہجوم کے حالات میں بھی دیکھا جا سکتا ہے (ضمنی شکل 2c)۔ایل ایل پی ایس کے عمل میں سی ٹرمینل αS خطے کا کردار، لیکن اس کی پوری لمبائی کا نہیں، سی-ٹرمینل کا استعمال کرتے ہوئے بوندوں کی تشکیل کی روک تھام کے ذریعے ظاہر کیا گیا تھا جس میں (ΔCt-) کی باقیات 104–140 (تصویر 1a) کی کمی ہے۔ αS) پروٹین (تصویر 2f اور ضمنی شکل 2d)۔αS اور ΔNt-Tau کے اجتماعی ہونے کی تصدیق کنفوکل فلوروسینس مائیکروسکوپی (ضمنی شکل 1b) سے ہوئی۔
Tau441 اور αS کے درمیان LLPS میکانزم کو مزید جانچنے کے لیے، ایک اضافی Tau ویریئنٹ استعمال کیا گیا، یعنی مائکروٹوبول بائنڈنگ ڈومین (MTBD) میں جوڑا ہیلیکل فلیمینٹ کور (PHF) ٹکڑا، جو کہ اگر اس میں چار خصوصیت والے ریپیٹ ڈومینز ہیں، عام طور پر بھی جانا جاتا ہے۔ K18 ٹکڑے کے طور پر (دیکھیں تصویر 2e)۔حال ہی میں یہ اطلاع دی گئی ہے کہ αS ترجیحی طور پر ایک پرولین سے بھرپور ڈومین میں واقع تاؤ پروٹین سے منسلک ہوتا ہے جو مائکروٹوبول بائنڈنگ ڈومین سے پہلے ہوتا ہے۔تاہم، پی ایچ ایف کا خطہ مثبت طور پر چارج شدہ اوشیشوں سے بھی مالا مال ہے (شکل 2e دیکھیں)، خاص طور پر لائسین (15٪ اوشیشوں)، جس نے ہمیں یہ جانچنے پر اکسایا کہ آیا یہ خطہ αS/Tau کمپلیکس کی گاڑھائی میں بھی حصہ ڈالتا ہے۔ہم نے مشاہدہ کیا کہ K18 اکیلے 100 μM تک ارتکاز پر LLPS کو آزمائشی شرائط کے تحت متحرک نہیں کر سکتا (15% PEG یا 20% dextran کے ساتھ LLPS بفر) (شکل 2f)۔تاہم، جب ہم نے 50 µM αS کو 50 µM K18 میں شامل کیا، K18 اور αS پر مشتمل پروٹین کی بوندوں کی تیزی سے تشکیل کا مشاہدہ nephelometry (ضمنی شکل 2d) اور WF مائکروسکوپی (تصویر 2f) کے ذریعے کیا گیا۔جیسا کہ توقع کی گئی تھی، ΔCt-αS K18 (تصویر 2f) کے LLPS رویے کو بحال کرنے میں ناکام رہا۔ہم نوٹ کرتے ہیں کہ αS/ΔNt-Tau یا αS/Tau441 کے مقابلے میں αS/ΔNt-Tau یا αS/Tau441 کے مقابلے میں αS/K18 کی جمع میں قدرے زیادہ پروٹین کی تعداد کی ضرورت ہوتی ہے، دیگر چیزیں برابر ہوتی ہیں۔یہ مائکروٹوبول بائنڈنگ ڈومین کے مقابلے میں پرولین سے بھرپور تاؤ ڈومین کے ساتھ αS C-ٹرمینل خطے کے مضبوط تعامل کے ساتھ مطابقت رکھتا ہے، جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے 31۔
یہ دیکھتے ہوئے کہ ΔNt-Tau αS کی غیر موجودگی میں LLPS انجام نہیں دے سکتا، ہم نے αS/Tau LLPS کو مکمل طوالت والے Tau (isotype, Tau441/Tau441) کے ساتھ LLPS سسٹمز میں اس کی سادگی کے پیش نظر αS/Tau LLPS کی خصوصیت کے لیے ایک ماڈل کے طور پر اس Tau قسم کا انتخاب کیا۔پیچیدہ (heterotypic، αS/Tau441) جمع کرنے کے عمل کے ساتھ۔ہم نے αS/Tau اور αS/ΔNt-Tau سسٹمز میں سنٹرفیوگریشن اور منتشر فیز SDS-PAGE تجزیہ (دیکھیں 2e) میں αS جمع کی ڈگری (کنڈینسڈ فیز پروٹین، fαS,c کے حصے کے طور پر) کا موازنہ کیا، بہت ملتی جلتی قدریں ملیں۔ ایک ہی حراستی میں تمام پروٹینوں کے لئے۔خاص طور پر، ہم نے αS/Tau اور αS/ΔNt-Tau کے لیے بالترتیب fαS,c 84 ± 2% اور 79 ±7% حاصل کیے، یہ تجویز کرتے ہیں کہ αS اور tau کے درمیان heterotypic تعامل تاؤ مالیکیولز کے درمیان تعامل سے بہتر ہے۔کے درمیان
مختلف پولی کیشنز کے ساتھ تعامل اور αS کائینیٹکس پر گاڑھا ہونے کے عمل کے اثر کا سب سے پہلے فوٹو بلیچنگ (FRAP) طریقہ کے بعد فلوروسینس ریکوری کے ذریعے مطالعہ کیا گیا۔ہم نے αS/Tau441، αS/ΔNt-Tau اور αS/pLK coacervates (100 μM αS کو 2 μM αS AF488-αS اور 100 μM Tau441 یا ΔNt-Tau یا 1 mM pLK کے ساتھ ضمیمہ کیا گیا) کا تجربہ کیا۔نمونے کے اجزاء کو ملانے کے بعد پہلے 30 منٹ کے اندر ڈیٹا حاصل کیا گیا۔نمائندہ FRAP امیجز (تصویر 3a، αS/Tau441 کنڈینسیشن) اور ان کے متعلقہ ٹائم کورس کے منحنی خطوط (تصویر 3b، ضمنی شکل 3) سے، یہ دیکھا جا سکتا ہے کہ αS کائینیٹکس Tau441 coacervates سے بہت ملتے جلتے ہیں۔اور ΔNt-Tau، جو pLK کے ساتھ بہت تیز ہے۔FRAP (جیسا کہ Kang et al. 35 نے بیان کیا ہے) کے مطابق coacervate کے اندر αS کے لیے حسابی ڈفیوژن گتانک D = 0.013 ± 0.009 µm2/s اور D = 0.026 ± 0.008 µm2/s برائے αS/TauΔ4 کے لیے اور αN/Tα4 کے لیے ہیں۔ αS/ سسٹم۔pLK، Tau، اور D = 0.18 ± 0.04 µm2/s، بالترتیب (تصویر 3c)۔تاہم، منتشر مرحلے میں ڈفیوژن گتانک αS تمام گاڑھا مراحل سے زیادہ شدت کے کئی آرڈرز ہیں، جیسا کہ فلوروسینس کوریلیشن سپیکٹروسکوپی (FCS، دیکھیں ضمیمہ تصویر 3) انہی حالات میں (LLPS بفر) لیکن پولی کیشنز کی عدم موجودگی میں۔ ( D = 8 ± 4 µm2/s)۔لہٰذا، αS ترجمہ کی حرکیات کوسیرویٹس میں منتشر مرحلے میں پروٹین کے مقابلے میں نمایاں طور پر کم ہو جاتی ہے کیونکہ واضح مالیکیولر کراؤڈنگ اثرات کی وجہ سے، حالانکہ تمام کوسرویٹس اپنی تشکیل کے بعد پہلے آدھے گھنٹے کے دوران مائع جیسی خصوصیات کو برقرار رکھتے ہیں، ٹاؤ مرحلے کے برعکس۔pLK کنڈینسیٹ میں تیز حرکیات۔
الیکٹرو اسٹاٹک کوسرویٹس میں αS حرکیات (2% AF488 لیبل والا αS) کا a–c FRAP تجزیہ۔سہ رخی میں αS/Tau441 FRAP اسیس کی نمائندہ تصاویر (a) میں دکھائی گئی ہیں، جہاں سرخ حلقے رنگین علاقوں کی نشاندہی کرتے ہیں۔اسکیل بار 5 µm ہے۔b اوسط FRAP منحنی خطوط اور (c) 100 µM αS اور Tau441 (سرخ) یا ΔNt-Tau (نیلا) یا pLK (سبز) کے مساوی ارتکاز کا استعمال کرتے ہوئے تین تجربات سے 5–6 (N) مختلف بوندوں کے لیے کیلکولیڈ ڈفیوژن کوفیشینٹس (D) LLPS کے دس گنا ارتکاز پر۔FRAP وکر کا معیاری انحراف سایہ دار رنگ میں دکھایا گیا ہے۔مقابلے کے لیے، منتشر مرحلے میں بازی گتانک αS کا تعین فلوروسینس کوریلیشن اسپیکٹروسکوپی (FCS) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا (مزید معلومات کے لیے ضمنی شکل 3 اور طریقے دیکھیں)۔d بغیر کسی پولی کیشن (سیاہ) کے LLPS بفر میں 100 μM TEMPOL-122-αS کا مسلسل X-band EPR سپیکٹرا یا 100 μM Tau441 (سرخ) یا ΔNt-Tau (نیلا) یا 1 mM pLK (سبز) کی موجودگی میں۔انسیٹ مضبوط فیلڈ لائنوں کا ایک بڑھا ہوا منظر دکھاتا ہے جہاں سب سے زیادہ ڈرامائی تبدیلیاں واقع ہوتی ہیں۔e 50 μM TEMPOL-122-αS کے بائنڈنگ منحنی خطوط جس میں LLPS کی غیر موجودگی میں مختلف پولی کیشنز (کوئی PEG نہیں)۔نارملائزڈ EPR سپیکٹرم کے بینڈ II (IIII/III) کے مقابلے میں بینڈ III کا کم طول و عرض Tau441 (سرخ)، ΔNt-Tau (نیلا) اور pLK (سبز) کے داڑھ کے تناسب کو بڑھانے کے لیے دکھایا گیا ہے۔رنگین لائنیں ہر ایک منحنی خطوط پر n ایک جیسی اور آزاد بائنڈنگ سائٹس کے ساتھ کسی نہ کسی طرح کے بائنڈنگ ماڈل کا استعمال کرتے ہوئے ڈیٹا کے لیے موزوں دکھائی دیتی ہیں۔خام ڈیٹا خام ڈیٹا فائلوں کی شکل میں فراہم کیا جاتا ہے۔
ایک تکمیل کے طور پر، ہم نے ڈائریکٹڈ اسپن لیبلنگ (SDSL) اور مسلسل الیکٹران پیرا میگنیٹک گونج (CW-EPR) کا استعمال کرتے ہوئے مختلف coacervates میں αS کی حرکیات کی چھان بین کی۔یہ طریقہ حقیقت پسندانہ بقایا ریزولوشن 36,37,38 کے ساتھ IDP کی لچک اور حرکیات کو رپورٹ کرنے میں بہت مفید ثابت ہوا ہے۔اس مقصد کے لیے، ہم نے سنگل Cys mutants میں سسٹین کی باقیات بنائی اور 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL) اسپن پروب کا استعمال کیا۔Maleimide مشتق ان پر لیبل لگاتے ہیں۔مزید خاص طور پر، ہم نے پوزیشن 122 یا 24 αS (TEMPOL-122-αS اور TEMPOL-24-αS) پر TEMPOL تحقیقات داخل کیں۔پہلی صورت میں، ہم پروٹین کے سی ٹرمینل خطے کو نشانہ بناتے ہیں، جو پولی کیشنز کے ساتھ تعامل میں شامل ہے۔اس کے بجائے، پوزیشن 24 ہمیں کنڈینسیٹ میں پروٹین کی مجموعی حرکیات کے بارے میں معلومات دے سکتی ہے۔دونوں صورتوں میں، منتشر مرحلے کے پروٹینز کے لیے حاصل کیے گئے EPR سگنلز تیزی سے حرکت کرنے والی حالت میں نائٹرو آکسائیڈ ریڈیکلز کے مساوی تھے۔تاؤ یا pLK کی موجودگی میں مرحلے کی علیحدگی کے بعد (100 μM TEMPOL-αS، Tau441 یا ΔNt-Tau 1:1 کے تناسب سے یا pLK 1:10 کے تناسب سے)، رشتہ دار چوٹی کی شدت میں اضافہ دیکھا گیا۔ αS کا EPR سپیکٹرم۔نقصان کی لکیر وسیع ہو گئی، جس سے پتہ چلتا ہے کہ قطرہ قطرہ میں پروٹین کے مقابلے میں αS کی بحالی کائینیٹکس کم ہو گیا ہے (تصویر 3d، ضمنی شکل 4a)۔یہ تبدیلیاں پوزیشن 122 پر زیادہ واضح ہیں۔ جبکہ پوزیشن 24 پر pLK کی موجودگی نے تحقیقات کے حرکیات کو متاثر نہیں کیا، پوزیشن 122 پر اسپیکٹرل لائن کی شکل نمایاں طور پر تبدیل ہوئی (ضمیمہ تصویر 4a)۔جب ہم نے عام طور پر اسپن لیبل والے IDP38,39 کی حرکیات کو بیان کرنے کے لیے استعمال ہونے والے isotropic ماڈل (ضمنی شکل 5a) کا استعمال کرتے ہوئے دو αS/polycation سسٹمز کی پوزیشن 122 پر سپیکٹرا کو ماڈل کرنے کی کوشش کی، تو ہم تجرباتی سپیکٹرا کی تشکیل نو کرنے سے قاصر تھے۔.24 اسپن کنٹراسٹ کی پوزیشن کا اسپیکٹرل تخروپن (ضمنی شکل 5a)۔اس سے پتہ چلتا ہے کہ پولی کیشنز کی موجودگی میں αS کے C-ٹرمینل ریجن کے اسپن کنفیگریشن کی جگہ میں ترجیحی پوزیشنیں ہیں۔تجرباتی EPR حالات کے تحت گاڑھا مرحلے میں αS کے کسر پر غور کرتے وقت (84 ± 2%، 79 ± 7%، اور 47 ± 4% برائے αS/Tau441، αS/ΔNt-Tau، اور αS/pLK، بالترتیب — دیکھیں ضمیمہ اعداد و شمار کے تجزیہ کی تصویر 2e c)، یہ دیکھا جا سکتا ہے کہ EPR طریقہ کار کے ذریعے پائے جانے والے وسعت بنیادی طور پر αS کے C-ٹرمینل خطے کے کنڈینسڈ مرحلے میں مختلف پولی کیشنز کے ساتھ تعامل کی عکاسی کرتی ہے (TEMPOL-122 کا استعمال کرتے وقت اہم تبدیلی۔ αS)، اور پروٹین گاڑھا ہونا نہیں۔تحقیقات میں مائکرووسکوسٹی میں اضافہ دیکھا گیا ہے۔جیسا کہ توقع کی گئی تھی، LLPS کے علاوہ دیگر حالات میں پروٹین کا EPR سپیکٹرم مکمل طور پر بحال ہو گیا تھا جب مرکب میں 1 M NaCl شامل کیا گیا تھا (ضمیمہ تصویر 4b)۔مجموعی طور پر، ہمارے اعداد و شمار سے پتہ چلتا ہے کہ CW-EPR کے ذریعہ پائی جانے والی تبدیلیاں بنیادی طور پر αS کے C-ٹرمینل ریجن کے تعامل کی عکاسی کرتی ہیں جس میں مختلف پولی کیشنز کے ساتھ گاڑھا ہوا، اور یہ تعامل تاؤ کے مقابلے pLK کے ساتھ زیادہ مضبوط معلوم ہوتا ہے۔
coacervate میں پروٹین کے بارے میں مزید ساختی معلومات حاصل کرنے کے لیے، ہم نے حل میں NMR کا استعمال کرتے ہوئے LLPS سسٹم کا مطالعہ کرنے کا فیصلہ کیا۔تاہم، ہم صرف منتشر مرحلے میں باقی αS حصے کا پتہ لگا سکتے ہیں، جس کی وجہ کوسرویٹ کے اندر پروٹین کی حرکیات میں کمی اور NMR تجزیہ میں حل کے نچلے حصے میں گھنے مرحلے کی وجہ سے ہو سکتا ہے۔جب ہم نے NMR (ضمنی شکل 5c، d) کا استعمال کرتے ہوئے LLPS نمونے کے منتشر مرحلے میں باقی پروٹین کی ساخت اور حرکیات کا تجزیہ کیا تو ہم نے دیکھا کہ پروٹین pLK اور ΔNt-Tau کی موجودگی میں تقریباً ایک جیسا برتاؤ کرتا ہے، دونوں جو کہ پروٹین ریڑھ کی ہڈی کی ثانوی ساخت اور حرکیات میں تھے، ثانوی کیمیکل شفٹ اور R1ρ نرمی کے تجربات سے انکشاف ہوا ہے۔NMR ڈیٹا سے پتہ چلتا ہے کہ αS کے C-ٹرمنس کو پولی کیشنز کے ساتھ تعامل کی وجہ سے، باقی پروٹین کی ترتیب کی طرح، اپنی خراب نوعیت کو برقرار رکھتے ہوئے تعمیری لچک کے نمایاں نقصان کا سامنا کرنا پڑتا ہے۔
چونکہ TEMPOL-122-αS کنڈینسڈ مرحلے میں مشاہدہ کردہ CW-EPR سگنل کی توسیع پولی کیشنز کے ساتھ پروٹین کے تعامل کی عکاسی کرتی ہے، اس لیے ہم نے LLPS کی غیر موجودگی میں αS کے مختلف پولی کیشنز سے منسلک وابستگی کا اندازہ کرنے کے لیے EPR ٹائٹریشن انجام دیا (کوئی جمع نہیں بفر ایل ایل پی ایس)، تجویز کرتا ہے کہ تعاملات کمزور اور مرتکز مراحل میں یکساں ہیں (جس کی تصدیق ہمارے اعداد و شمار، ضمنی شکل 4a اور ضمنی شکل 6 سے ہوتی ہے)۔مقصد یہ دیکھنا تھا کہ کیا تمام کوسرویٹس، اپنی عام سیال جیسی خصوصیات کے باوجود، سالماتی سطح پر کسی بھی بنیادی تفریق کی نمائش کرتے ہیں۔جیسا کہ توقع کی گئی ہے، ای پی آر سپیکٹرم بڑھتے ہوئے پولی کیشن ارتکاز کے ساتھ وسیع ہوا، جو کہ تمام تعاملاتی شراکت داروں کے مالیکیولر تعاملات کی وجہ سے سالماتی لچک میں کمی کو ظاہر کرتا ہے (تصویر 3e، ضمنی شکل 6)۔pLK نے یہ سنترپتی ΔNt-Tau اور Tau441 کے مقابلے میں کم داڑھ تناسب (polycation:αS) پر حاصل کی۔درحقیقت، n ایک جیسی اور آزاد بائنڈنگ سائٹس کو فرض کرتے ہوئے تخمینی بائنڈنگ ماڈل کے ساتھ ڈیٹا کا موازنہ ظاہر کرتا ہے کہ pLK (~5 μM) کا ظاہری انحطاط مستقل Tau441 یا ΔNt-Tau (~50 μM) سے کم شدت کا حکم ہے۔ )۔µM)۔اگرچہ یہ ایک موٹا تخمینہ ہے، لیکن اس سے پتہ چلتا ہے کہ αS کو مسلسل مثبت چارج والے علاقوں کے ساتھ آسان پولی کیشنز سے زیادہ لگاؤ ​​ہے۔αS اور مختلف پولی کیشنز کے درمیان وابستگی میں اس فرق کو دیکھتے ہوئے، ہم نے قیاس کیا کہ ان کی مائع خصوصیات وقت کے ساتھ مختلف طریقے سے تبدیل ہو سکتی ہیں اور اس طرح مختلف LSPT عمل سے دوچار ہیں۔
پروٹین coacervate کے اندر انتہائی ہجوم والے ماحول اور پروٹین کی amyloid فطرت کو دیکھتے ہوئے، ہم نے LSPT کے ممکنہ عمل کا پتہ لگانے کے لیے وقت کے ساتھ ساتھ coacervate کے رویے کا مشاہدہ کیا۔BF اور CF مائیکروسکوپی (شکل 4) کا استعمال کرتے ہوئے، ہم نے مشاہدہ کیا کہ αS/Tau441 حل میں کافی حد تک ہم آہنگ ہوتا ہے، بڑی بوندوں کی تشکیل کرتا ہے جو کنویں کے نچلے حصے میں مکمل بوندوں کے طور پر / سلائیڈ سے رابطہ کرتا ہے اور سطح کو گیلا کرتا ہے، جیسا کہ توقع کی جاتی ہے (ضمیمہ انجیر۔ 7d)ہم نیچے سے بنے ہوئے ڈھانچے کو "پروٹین رافٹس" کہتے ہیں۔یہ ڈھانچے سیال رہے کیونکہ انہوں نے فیوز کرنے کی صلاحیت کو برقرار رکھا (ضمنی شکل 7b) اور ایل ایل پی ایس کے متحرک ہونے کے بعد کئی گھنٹوں تک دیکھا جا سکتا تھا (تصویر 4 اور ضمنی شکل 7c)۔ہم نے مشاہدہ کیا کہ گیلا کرنے کا عمل ہائیڈروفوبک مواد (ضمنی شکل 7a) کے بجائے ہائیڈرو فیلک کی سطح پر پسند کیا جاتا ہے، جیسا کہ غیر متوازن چارجز اور اس طرح اعلی الیکٹرو اسٹاٹک سطح کی صلاحیتوں کے ساتھ الیکٹرو اسٹاٹک کوسرویٹس کے لیے توقع کی جاتی ہے۔خاص طور پر، αS/ΔNt-Tau coalescence اور rafting کو نمایاں طور پر کم کیا گیا تھا، جبکہ αS/pLK کنڈینسیٹس کو نمایاں طور پر کم کیا گیا تھا (تصویر 4)۔انکیوبیشن کے مختصر وقت کے دوران، αS/pLK بوندیں ہائیڈرو فیلک سطح کو اکٹھا اور گیلا کرنے کے قابل تھیں، لیکن یہ عمل تیزی سے رک گیا اور 5 گھنٹے کے انکیوبیشن کے بعد، صرف محدود اتحاد کے واقعات اور کوئی گیلا نہیں دیکھا گیا۔جیل ڈرپ کی منتقلی
ایل ایل پی ایس بفر میں 100 µM αS (1% فلوروسینٹ لیبل) پر مشتمل coacervate نمونوں کے نمائندہ BF (گرے اسکیل پینلز) اور CF (دائیں پینلز، AF488-سبز رنگ میں αS) -Tau (مرکز) یا 1 mM pLK (نیچے) مختلف انکیوبیشن اوقات اور فوکل ہائٹس پر (z، پلیٹ کے نیچے سے اچھی طرح سے فاصلہ)۔تجربات کو ایک ہی نتائج کے ساتھ ایک دوسرے سے آزادانہ طور پر 4-6 بار دہرایا گیا۔αS/Tau441 coacervates 24 گھنٹوں کے بعد گیلے ہو جاتے ہیں، جس سے تصویر سے بڑا بیڑا بنتا ہے۔تمام تصاویر کے لیے اسکیل بار 20 µm ہے۔
اس کے بعد ہم نے پوچھا کہ کیا αS/Tau441 LLPS میں بننے والے بڑے سیال نما پروٹین کے تالاب مطالعہ کیے گئے کسی بھی پروٹین کی امائلائیڈ جمع کا باعث بنیں گے۔ہم نے WF مائیکروسکوپی کے ساتھ وقت کے ساتھ ساتھ αS/Tau441 بوندوں کی پختگی کی پیروی کی جیسا کہ اوپر کی طرح ہے، لیکن 1 μM AF488 لیبل والے αS اور Atto647N لیبل والے Tau441 (تصویر 5a) کا استعمال کرتے ہوئے۔جیسا کہ توقع کی گئی تھی، ہم نے پختگی کے پورے عمل میں مکمل پروٹین لوکلائزیشن کا مشاہدہ کیا۔دلچسپ بات یہ ہے کہ ca سے۔5 گھنٹے کے بعد، رافٹس کے اندر زیادہ شدید غیر سرکلر ڈھانچے کا مشاہدہ کیا گیا، جسے ہم "پوائنٹس" کہتے ہیں، جن میں سے کچھ کو αS کے ساتھ اکٹھا کیا گیا تھا، اور کچھ Tau441 (تصویر 5a، سفید تیر) میں افزودہ تھے۔یہ دھبے ہمیشہ αS/ΔNt-Tau کے مقابلے میں αS/ΔNt-Tau کے لیے زیادہ حد تک رافٹس کے اندر دیکھے گئے ہیں۔pLK اور Tau سسٹم کی بوندوں میں کوئی الگ دھبہ نہیں تھا جو فیوژن/گیلا کرنے کے لیے نااہل تھا۔یہ جانچنے کے لیے کہ آیا αS اور Tau441 پر مشتمل یہ داغ amyloid نما مجموعے ہیں، ہم نے CF مائیکروسکوپی کا استعمال کرتے ہوئے ایک ایسا ہی تجربہ کیا جس میں Tau441 پر Atto647N کا لیبل لگا ہوا تھا اور 12.5 μM amyloid-specific thioflavin-T (ThT) کو شروع سے شامل کیا گیا تھا۔رنگنااگرچہ αS/Tau441 بوندوں یا رافٹس کے ThT-داغدار ہونے کا مشاہدہ 24 گھنٹے کے انکیوبیشن کے بعد بھی نہیں کیا گیا تھا (تصویر 5b، سب سے اوپر کی قطار — پروٹین رافٹس پر باقی بوندیں)، رافٹس کے اندر Atto647N-Tau441 پر مشتمل ThT-مثبت ڈھانچے بہت کمزور تھے۔یہ پہلے بیان کردہ دھبوں کے سائز، شکل اور مقام کی نقل کرتا ہے (تصویر 5b، درمیانی اور نیچے کی قطاریں)، یہ تجویز کرتا ہے کہ یہ دھبے عمر رسیدہ سیال کوسرویٹس میں بننے والے امائلائیڈ نما مجموعوں سے مطابقت رکھتے ہیں۔
LLPS buffer کے ساتھ مائکروسکوپ پلیٹ کے کنویں میں 25 μM Tau441 (1 μM AF488- لیبل αS اور Atto647N- لیبل والے Tau441) کی موجودگی میں مختلف انکیوبیشن اوقات اور فوکل ہائٹس (z، نیچے سے فاصلہ) پر WF 25 μM αS) .اسی طرح کے نتائج کے ساتھ چھ تجربات آزادانہ طور پر دہرائے گئے۔b 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N- لیبلڈ Tau441) اور 12.5 μM thioflavin-T (ThT) کی موجودگی میں 25 μM αS کی سی ایف مائکروسکوپک تصویر۔وزنی پروٹین کی بوندیں اور جمع شدہ پروٹین رافٹس اور دھبے بالترتیب اوپر اور درمیانی قطاروں میں دکھائے گئے ہیں۔نیچے کی قطار 3 آزاد نقلوں سے رافٹس اور قطروں کی تصاویر دکھاتی ہے۔سفید تیر دونوں پینلز میں ThT-مثبت نقطوں کی نشاندہی کرتے ہیں۔تمام تصاویر کے لیے اسکیل بار 20 µm ہے۔
مائع سے ٹھوس میں منتقلی کے دوران کوسرویٹ پروٹین نیٹ ورک میں ہونے والی تبدیلیوں کا مزید تفصیل سے جائزہ لینے کے لیے، ہم نے فلوروسینس لائف ٹائم امیجنگ (FLIM) اور Förster Resonance Energy Transfer microscopy (FRET) (شکل 6 اور ضمنی اعداد و شمار 8 اور 9) کا استعمال کیا۔ہم نے یہ قیاس کیا کہ پرت کی کوسرویٹ پختگی زیادہ گاڑھا یا اس سے بھی ٹھوس جیسے مجموعی پروٹین ڈھانچے میں پروٹین اور اس سے منسلک فلوروسینٹ پروب کے درمیان قریبی رابطے کا باعث بنتی ہے، جس سے ممکنہ طور پر ایک بجھانے والا اثر پیدا ہوتا ہے جو ایک مختصر تحقیقاتی زندگی میں ظاہر ہوتا ہے (τ) جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے 40۔،41،42۔اس کے علاوہ، ڈبل لیبل والے نمونوں کے لیے (AF488 اور Atto647N بطور FRET ڈونر اور قبول کرنے والے رنگ، بالترتیب)، τ میں اس کمی کو LSPT کے دوران coacervate کنڈینسیشن اور FRET(E) کی کارکردگی میں اضافہ کے ساتھ بھی ہو سکتا ہے۔ہم نے LLPS αS/Tau441 اور αS/ΔNt-Tau نمونوں میں وقت کے ساتھ ساتھ بیڑا اور جگہ کی تشکیل کی نگرانی کی (LLPS بفر میں ہر پروٹین کا 25 µM جس میں 1 µM AF488 کا لیبل لگا ہوا αS اور/یا Atto647N کا لیبل لگا ہوا Tau441 یا ΔNt-Tau)۔ہم نے ایک عمومی رجحان کا مشاہدہ کیا کہ AF488 (τ488) اور Atto647N (τ647N) تحقیقات کے فلوروسینس لائف ٹائم میں تھوڑا سا کمی واقع ہوئی کیونکہ کوسرویٹس پختہ ہو گئے (تصویر 6 اور ضمنی شکل 8c)۔دلچسپ بات یہ ہے کہ اس تبدیلی کو رافٹس (تصویر 6c) کے اندر موجود نقطوں کے لیے نمایاں طور پر بڑھایا گیا تھا، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ نقطوں پر مزید پروٹین گاڑھا ہونا واقع ہوا ہے۔اس کی حمایت میں، αS/ΔNt-Tau بوندوں کی عمر میں 24 گھنٹے (ضمنی شکل 8d) کے لیے فلوروسینس لائف ٹائم میں کوئی خاص تبدیلی نہیں دیکھی گئی، یہ تجویز کرتا ہے کہ ڈراپلیٹ جیلیشن ایک ایسا عمل ہے جو اسپاٹنگ سے الگ ہے اور اس کے ساتھ اہم مالیکیولر ری آرگنائزیشن نہیں ہے۔ coacervates کے اندر.واضح رہے کہ نقطوں کے αS میں مختلف سائز اور متغیر مواد ہوتے ہیں، خاص طور پر αS/Tau441 سسٹم کے لیے (ضمیمہ تصویر 8e)۔اسپاٹ فلوروسینس لائف ٹائم میں کمی شدت میں اضافے کے ساتھ تھی، خاص طور پر Atto647N کے لیے Tau441 (ضمنی شکل 8a) کا لیبل لگا ہوا تھا، اور αS/Tau441 اور αS/ΔNt-Tau دونوں نظاموں کے لیے اعلیٰ FRET افادیت، جو کہ مزید گاڑھا ہونے کے پانچ گھنٹے کی نشاندہی کرتی ہے۔ متحرک ہونے کے بعد، جامد بجلی کے اندر موجود پروٹین گاڑھا ہو جاتے ہیں۔αS/ΔNt-Tau کے مقابلے میں، ہم نے αS/Tau441 مقامات میں کم τ647N اور کچھ زیادہ τ488 قدروں کا مشاہدہ کیا، اس کے ساتھ نچلی اور زیادہ غیر ہم جنس FRET قدریں تھیں۔ممکنہ طور پر، اس کا تعلق اس حقیقت سے ہو سکتا ہے کہ αS/Tau441 نظام میں، مشاہدہ شدہ اور متوقع αS کی کثرت مجموعی طور پر زیادہ متضاد ہے، اکثر Tau کے مقابلے میں ذیلی اسٹوچیومیٹرک ہے، کیونکہ Tau441 خود بھی LLPS اور جمع سے گزر سکتا ہے (ضمنی شکل 8e) .تاہم، قطرہ قطرہ کے ہم آہنگی، بیڑے کی تشکیل، اور اہم بات یہ ہے کہ مائع نما کوسرویٹس کے اندر پروٹین کی جمع زیادہ سے زیادہ ہے جب Tau441 اور αS دونوں موجود ہوں۔
ہر ایک پروٹین کے 25 μM پر αS/Tau441 اور αS/ΔNt-Tau کی لائف ٹائم فلوروسینس مائیکروسکوپی (FLIM) تصاویر (1 μM AF488 لیبل والا αS اور 1 μM Atto647N- لیبل والا Tau441 یا ΔNt-Tau LLPS buff) میں۔کالم مختلف پختگی کے اوقات (30 منٹ، 5 گھنٹے اور 24 گھنٹے) پر ایل ایل پی ایس نمونوں کی نمائندہ تصاویر دکھاتے ہیں۔سرخ فریم αS/Tau441 مقامات پر مشتمل خطہ دکھاتا ہے۔زندگی کے دورانیے کو رنگین سلاخوں کے طور پر دکھایا گیا ہے۔اسکیل بار = 20 µm تمام تصاویر کے لیے۔b منتخب علاقے کی زوم ان FLIM تصویر، پینل a میں سرخ باکس میں دکھائی گئی ہے۔لائف رینجز کو اسی رنگ کے پیمانے کا استعمال کرتے ہوئے دکھایا گیا ہے جیسا کہ پینل اے میں ہے۔اسکیل بار = 5 µm۔c ہسٹوگرام جس میں AF488 (αS سے منسلک) یا Atto647N (Tau سے منسلک) مختلف پروٹین پرجاتیوں (droplets-D-، raft-R- اور speckle-P) کو دکھایا گیا ہے جو αS- کے لیے ریکارڈ کردہ FLIM امیجز میں شناخت کیے گئے ہیں Tau441 اور αS/ΔNt-Tau coacervate نمونے (D کے لیے N = 17-32 ROI، R کے لیے 29-44 ROI، اور پوائنٹس کے لیے 21-51 ROI)۔اوسط اور درمیانی قدروں کو بالترتیب خانوں کے اندر پیلے چوکور اور سیاہ لکیروں کے طور پر دکھایا گیا ہے۔باکس کی نچلی اور اوپری حدیں بالترتیب پہلے اور تیسرے کوارٹائل کی نمائندگی کرتی ہیں، اور 1.5 گنا انٹرکوارٹائل رینج (IQR) کے اندر کم از کم اور زیادہ سے زیادہ اقدار کو سرگوشی کے طور پر دکھایا گیا ہے۔آؤٹ لیرز کو سیاہ ہیروں کے طور پر دکھایا گیا ہے۔تقسیم کے جوڑوں کے درمیان شماریاتی اہمیت کا تعین غیر مساوی تغیرات کو فرض کرتے ہوئے، دو نمونے والے ٹی ٹیسٹ کے ذریعے کیا گیا تھا۔دو دم والے t-ٹیسٹ p-values ​​کو مقابلے کے ڈیٹا کے ہر جوڑے کے لیے ستارے کے ساتھ دکھایا گیا ہے (* p-value > 0.01, ** p-value > 0.001, *** p-value > 0.0001, **** p-value > 0.00001)، ns نفی کی نشاندہی کرتا ہے (p-value > 0.05)۔p کی درست قدریں ضمنی جدول 1 میں دی گئی ہیں، اور اصل ڈیٹا کو خام ڈیٹا فائلوں کے طور پر پیش کیا گیا ہے۔
داغوں/مجموعوں کی امائلائیڈ نما نوعیت کو مزید ظاہر کرنے کے لیے، ہم نے (1 M) NaCl کی اعلیٰ ارتکاز کے ساتھ 24 گھنٹے تک غیر داغدار کوسرویٹ نمونوں کا علاج کیا، جس کے نتیجے میں پروٹین کوسرویٹس سے ایگریگیٹس الگ ہو گئے۔جب اٹامک فورس مائکروسکوپی (AFM) کا استعمال کرتے ہوئے الگ تھلگ ایگریگیٹس (یعنی ایگریگیٹس کا منتشر محلول) کا مشاہدہ کیا گیا، تو ہم نے تقریباً 15 nm کی باقاعدہ اونچائی کے ساتھ بنیادی طور پر کروی شکل کا مشاہدہ کیا، جو زیادہ نمک کی ارتکاز کے حالات میں منسلک ہوتا ہے۔ سطح پر مضبوط ہائیڈروفوبک اثر کی وجہ سے عام امائلائیڈ فائبرلز کا برتاؤ (نوٹ کریں کہ فائبرلز کی اونچائی عام طور پر ~10 nm ہوتی ہے) (ضمیمہ تصویر 10a)۔دلچسپ بات یہ ہے کہ جب ایک معیاری ThT فلوروسینس پرکھ میں الگ تھلگ ایگریگیٹس کو ThT کے ساتھ لگایا گیا تھا، تو ہم نے ThT فلوروسینس کوانٹم کی پیداوار میں ڈرامائی اضافہ دیکھا، اس کے مقابلے میں جب ڈائی کو عام αS amyloid fibrils (اضافی F10b) کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ coacervate مجموعوں میں amyloid نما ڈھانچے ہوتے ہیں۔.درحقیقت، مجموعے نمک کی زیادہ مقدار کے لیے روادار تھے لیکن 4 M guanidine chloride (GdnHCl) کے لیے حساس تھے، جیسے عام امائلائیڈ فائبرلز (ضمیمہ انجیر۔ 10c)۔
اگلا، ہم نے سنگل مالیکیول فلوروسینس، مخصوص فلوروسینس ارتباط/کراس کوریلیشن اسپیکٹروسکوپی (FCS/FCCS)، اور دو رنگوں کے اتفاق کا پتہ لگانے (TCCD) کے برسٹ تجزیہ کا استعمال کرتے ہوئے مجموعی کی ساخت کا تجزیہ کیا۔اس مقصد کے لیے، ہم نے 100 μl LLPS نمونوں میں انکیوبیشن کے 24 گھنٹوں کے بعد بنائے گئے مجموعوں کو الگ تھلگ کیا جس میں αS اور Tau441 (دونوں 25 μM) ایک ساتھ 1 μM AF488- لیبل والے αS اور 1 μM Atto647N- لیبل والے Tau441 شامل ہیں۔LLPS اور پروٹین کے درمیان کسی بھی ممکنہ الیکٹرو اسٹاٹک تعامل کو روکنے کے لیے ایک ہی PEG فری بفر اور 1 M NaCl (وہی بفر جو کوسرویٹ سے ایگریگیٹس کو الگ کرنے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے) کا استعمال کرتے ہوئے نتیجے میں منتشر مجموعی محلول کو ایک مونومولیکولر حالت میں پتلا کریں۔ایک مالیکیول کے وقت کی رفتار کی ایک مثال تصویر 7a میں دیکھی جا سکتی ہے۔FCCS/FCS تجزیہ (کراس ارتباط، CC اور autocorrelation، AC) سے پتہ چلتا ہے کہ αS اور tau پر مشتمل مجموعے نمونوں میں بکثرت تھے (تصویر 7b، بائیں پینل میں CC وکر دیکھیں)، اور بقایا monomeric پروٹین کی زیادتی ایک کے طور پر پیدا ہوئی۔ کم کرنے کے عمل کا نتیجہ (شکل 7b، بائیں پینل میں AC منحنی خطوط دیکھیں)۔صرف monomeric پروٹینوں پر مشتمل نمونوں کا استعمال کرتے ہوئے ایک ہی حل کے حالات کے تحت کئے گئے کنٹرول تجربات میں کوئی CC منحنی خطوط نہیں دکھائے گئے، اور AC منحنی خطوط ایک جزو کے پھیلاؤ ماڈل (Eq. 4) کے ساتھ اچھی طرح سے فٹ ہوتے ہیں، جہاں monomeric پروٹینوں میں متوقع پھیلاؤ کے گتانک ہوتے ہیں (تصویر 7b) دائیں پینل)۔مجموعی ذرات کا بازی گتانک 1 µm2/s سے کم ہے، اور monomeric پروٹین کا تقریباً 1 µm2/s ہے۔50–100 µm/s؛قدریں sonicated αS amyloid fibrils اور monomeric αS کے لیے پہلے سے شائع شدہ اقدار سے ملتی جلتی ہیں۔جب ہم نے TCCD دھماکے کے تجزیہ (تصویر 7c، ٹاپ پینل) کے ساتھ مجموعوں کا تجزیہ کیا، تو ہم نے پایا کہ ہر الگ تھلگ مجموعی (αS/Tau heteroaggregate) میں، تقریباً 60% کا پتہ لگایا گیا مجموعی αS اور tau دونوں پر مشتمل ہے، تقریباً 30% صرف پر مشتمل ہے۔ tau، تقریباً 10% αS صرف۔αS/Tau heteroaggregates کے Stoichiometric تجزیہ سے پتہ چلتا ہے کہ زیادہ تر heteroaggregates کو تاؤ میں افزودہ کیا گیا تھا (0.5 سے نیچے stoichiometry، فی مجموعی tau مالیکیولز کی اوسط تعداد αS مالیکیولز سے 4 گنا زیادہ ہے)، جو کہ FLIM سیٹو میں ہمارے کام کے مطابق ہے۔ تجربات.FRET تجزیہ سے پتہ چلتا ہے کہ ان مجموعوں میں دونوں پروٹین موجود تھے، حالانکہ اس معاملے میں FRET کی اصل قدریں زیادہ اہمیت کی حامل نہیں ہیں، کیونکہ ہر ایک میں فلوروفورس کی تقسیم تجربے میں استعمال کیے گئے بغیر لیبل والے پروٹین کی زیادتی کی وجہ سے بے ترتیب تھی۔دلچسپ بات یہ ہے کہ جب ہم نے 45,46 بالغ امائلائیڈ ایگریگیشن کی کمی والے تاؤ ویرینٹ کا استعمال کرتے ہوئے وہی تجزیہ کیا (دیکھیں ضمنی شکل 11a,b)، ہم نے دیکھا کہ اگرچہ αS الیکٹرو سٹیٹک جمع ایک ہی تھا (ضمنی شکل 11c، d)، coacervate کے اندر ایگریگیٹس بنانے کی صلاحیت کافی حد تک کم ہو گئی تھی اور FLIM نے سیٹو تجربات میں کئی دھبوں کا پتہ لگایا تھا، اور الگ تھلگ مجموعی نمونوں کے لیے کمزور کراس ارتباط کے منحنی خطوط دیکھے گئے تھے۔تاہم، کھوئے گئے مجموعوں کی ایک چھوٹی سی تعداد کے لیے (Tau441 کا صرف ایک دسواں حصہ)، ہم نے مشاہدہ کیا کہ ہر مجموعی کو اس Tau قسم کے مقابلے αS میں افزودہ کیا گیا تھا، تقریباً 50% کا پتہ لگایا گیا مجموعی صرف αS مالیکیولز پر مشتمل تھا، اور αS ضرورت سے زیادہ متضاد تھا۔ .مجموعی (ضمیمہ تصویر 11e دیکھیں)، Tau441 (تصویر 6f) کے ذریعے پیدا ہونے والے متفاوت مجموعوں کے برعکس۔ان تجربات کے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ اگرچہ αS خود coacervate کے اندر تاؤ کے ساتھ جمع ہونے کی صلاحیت رکھتا ہے، لیکن ان حالات میں ٹاؤ نیوکلیشن زیادہ سازگار ہے، اور نتیجے میں پیدا ہونے والے امائلائیڈ نما مجموعے αS اور tau کی شکل کے طور پر کام کرنے کے قابل ہیں۔تاہم، ایک بار جب تاؤ سے بھرپور کور بن جاتا ہے، تو αS اور tau کے درمیان متضاد تعاملات کو تاؤ مالیکیولز کے درمیان ہوموٹائپک تعاملات پر مجموعی طور پر پسند کیا جاتا ہے۔ہم مائع αS/tau coacervates میں پروٹین نیٹ ورکس کا بھی مشاہدہ کرتے ہیں۔
αS/Tau441 electrostatic coacervates میں تشکیل پانے والے الگ تھلگ ایگریگیٹس کے واحد مالیکیولز کے نمائندہ فلوروسینس عارضی نشانات۔αS/Tau441 coaggregates (اشارہ کردہ حد سے اوپر پھٹنے) کے مساوی پھٹ تین پتہ لگانے والے چینلز میں دیکھے گئے (براہ راست جوش کے بعد AF488 اور Atto647N اخراج، نیلی اور سرخ لکیریں، Atto647N اخراج بالواسطہ جوش کے بعد)، FRET، وایلیٹ لائن)۔بی ایل ایل پی ایس (بائیں پینل) سے حاصل کردہ الگ تھلگ αS/Tau441 مجموعوں کے نمونے کا FCS/FCCS تجزیہ۔AF488 اور Atto647N کے لیے Autocorrelation (AC) منحنی خطوط بالترتیب نیلے اور سرخ رنگ میں دکھائے گئے ہیں، اور دونوں رنگوں پر مشتمل مجموعوں کے ساتھ منسلک کراس کوریلیشن (CC) کروز کو جامنی رنگ میں دکھایا گیا ہے۔AC منحنی خطوط پر مشتمل مونومیرک اور مجموعی پروٹین پرجاتیوں کی موجودگی کی عکاسی کرتے ہیں، جبکہ CC منحنی خطوط صرف ڈبل لیبل والے مجموعوں کا پھیلاؤ دکھاتے ہیں۔وہی تجزیہ، لیکن الگ تھلگ جگہوں کی طرح حل کے حالات کے تحت، صرف monomeric αS اور Tau441 پر مشتمل نمونے دائیں پینل میں بطور کنٹرول دکھائے جاتے ہیں۔c αS/Tau441 electrostatic coacervates میں تشکیل پانے والے الگ تھلگ مجموعوں کے واحد مالیکیولز کا فلوروسینس فلیش تجزیہ۔چار مختلف تکرار (N = 152) میں پائے جانے والے ہر مجموعی کے لیے معلومات کو ان کی سٹوچیومیٹری، S قدروں، اور FRET کارکردگی (ٹاپ پینل، کلر بار کی موجودگی کی عکاسی کرتا ہے) کے خلاف پلاٹ کیا گیا ہے۔مجموعوں کی تین اقسام میں فرق کیا جا سکتا ہے: S~1 اور FRET~0 کے ساتھ صرف αS-صرف مجموعے، S~0 اور FRET~1 کے ساتھ صرف Tau کے مجموعے، اور متضاد Tau/αS مجموعے کے ساتھ درمیانے درجے کے S اور FRET کے تخمینے ہر ایک متضاد مجموعی (N = 100) میں پائے جانے والے دونوں مارکر پروٹینوں کو نچلے پینل میں دکھایا گیا ہے (رنگ پیمانہ واقعہ کی عکاسی کرتا ہے)۔خام ڈیٹا خام ڈیٹا فائلوں کی شکل میں فراہم کیا جاتا ہے۔
مائع پروٹین کی پختگی یا عمر بڑھنے کے ساتھ جیل کی طرح یا ٹھوس ڈھانچے میں گاڑھا ہونا condensate47 کے کئی جسمانی افعال کے ساتھ ساتھ بیماری میں بھی شامل ہونے کی اطلاع ملی ہے، یہ ایک غیر معمولی عمل کے طور پر amyloid کی جمع 7, 48, 49 سے پہلے ہے۔ ہم مرحلے کی علیحدگی اور رویے کا تفصیل سے مطالعہ کرتے ہیں۔LSPT αS کم مائکرومولر ارتکاز اور جسمانی لحاظ سے متعلقہ حالات میں کنٹرول شدہ ماحول میں بے ترتیب پولی کیشنز کی موجودگی میں (نوٹ کریں کہ αS کا حساب شدہ جسمانی ارتکاز> 1 µM50 ہے)، LPS کے عام تھرموڈینامک طور پر چلنے والے رویے کے بعد۔ہم نے پایا کہ αS، جس میں جسمانی pH میں انتہائی منفی چارج شدہ C-ٹرمینل خطہ ہوتا ہے، ایل ایل پی ایس کے ذریعے پانی کے محلول میں پروٹین سے بھرپور بوندوں کو بنانے کے قابل ہے جیسے کہ pLK یا Tau کی موجودگی میں الیکٹرو سٹیٹک کے عمل کے ذریعے۔ جمع میکرو مالیکیولس کی موجودگی میں پیچیدہ سنکشیپن۔اس عمل کے سیلولر ماحول میں متعلقہ اثرات ہو سکتے ہیں جہاں αS وٹرو اور vivo51,52,53,54 دونوں میں اپنی بیماری سے وابستہ جمع سے وابستہ مختلف پولی کیشنک مالیکیولز کا سامنا کرتا ہے۔
بہت سے مطالعات میں، بوندوں کے اندر پروٹین کی حرکیات کو پختگی کے عمل کا تعین کرنے والے کلیدی عوامل میں سے ایک سمجھا جاتا ہے 55,56۔الیکٹرو اسٹاٹک αS پولی کیشنز کے ساتھ ہم آہنگ ہوتا ہے، پختگی کا عمل بظاہر پولی کیشنز کے ساتھ تعاملات کی طاقت، والینس اور ان تعاملات کی کثرت پر منحصر ہوتا ہے۔توازن کا نظریہ بتاتا ہے کہ دو مائع حالتوں کا توازن زمین کی تزئین میں بائیو پولیمر سے بھرپور ایک بڑی بوند کی موجودگی ہوگی جو LLPS57,58 کو چلاتی ہے۔Ostwald maturation59، coalescence60 یا dispersed stage61 میں مفت monomer کے استعمال سے قطرہ قطرہ کی نمو حاصل کی جا سکتی ہے۔αS اور Tau441، ΔNt-Tau یا pLK کے لیے، اس مطالعے میں استعمال ہونے والی شرائط کے تحت زیادہ تر پروٹین کو کنڈینسیٹ میں مرتکز کیا گیا تھا۔تاہم، جب کہ سطح کے گیلے ہونے پر پورے سائز کے تاؤ کی بوندیں تیزی سے اکٹھی ہو جاتی ہیں، ΔNt-Tau اور pLK کے لیے بوندوں کا ہم آہنگ ہونا اور گیلا ہونا مشکل تھا، جو ان دونوں نظاموں میں مائع خصوصیات کے تیزی سے نقصان کی تجویز کرتا ہے۔ہمارے FLIM-FRET تجزیے کے مطابق، عمر رسیدہ pLK اور ΔNt-Tau بوندوں نے اصل بوندوں کی طرح پروٹین کی جمع (مماثل فلوروسینس لائف ٹائم) کو دکھایا، جو تجویز کرتا ہے کہ اصل پروٹین نیٹ ورک کو برقرار رکھا گیا تھا، اگرچہ زیادہ سخت ہے۔
ہم مندرجہ ذیل ماڈل (شکل 8) میں اپنے تجرباتی نتائج کو معقول بناتے ہیں۔ابتدائی طور پر عارضی طور پر بننے والی بوندیں اکثر الیکٹرو اسٹاٹک معاوضے کے بغیر پروٹین نیٹ ورکس ہوتی ہیں، اور اس طرح چارج کے عدم توازن کے علاقے ہوتے ہیں، خاص طور پر قطرہ کے انٹرفیس پر، جس کے نتیجے میں بوندیں اعلی الیکٹرو اسٹاٹک سطح کی صلاحیت کے ساتھ ہوتی ہیں۔چارج کی تلافی کرنے کے لیے (ایک ایسا رجحان جسے عام طور پر ویلنس ڈیپلیشن کہا جاتا ہے) اور بوندوں کی سطح کی صلاحیت کو کم سے کم کرنے کے لیے، بوندوں میں کمزور مرحلے سے نئے پولی پیپٹائڈز شامل ہو سکتے ہیں، چارج چارج کے تعامل کو بہتر بنانے کے لیے پروٹین نیٹ ورکس کو دوبارہ ترتیب دے سکتے ہیں، اور دیگر بوندوں کے ساتھ تعامل کر سکتے ہیں۔سطحوں کے ساتھ (گیلا ہونا)۔αS/pLK بوندیں، ان کے آسان پروٹین نیٹ ورک (صرف αS اور pLK کے درمیان ہیٹروٹائپک تعاملات) اور پروٹین-پروٹین کے تعامل کے لیے زیادہ تعلق کی وجہ سے، ایسا لگتا ہے کہ کنڈینسیٹ کے چارج کو زیادہ تیزی سے متوازن کر سکتے ہیں۔درحقیقت، ہم نے ابتدائی طور پر تشکیل شدہ αS/pLK coacervates میں αS/Tau کے مقابلے میں تیز تر پروٹین کائنےٹکس کا مشاہدہ کیا۔والینس کی کمی کے بعد، تعاملات کم وقتی ہو جاتے ہیں اور بوندیں اپنی مائع خصوصیات سے محروم ہو جاتی ہیں اور جیل کی طرح، غیر آتش گیر بوندوں میں تبدیل ہو جاتی ہیں جن میں کم الیکٹرو سٹیٹک سطح کی صلاحیت ہوتی ہے (اور اس وجہ سے سطح کو گیلا نہیں کر پاتے)۔اس کے برعکس، αS/Tau بوندیں زیادہ پیچیدہ پروٹین نیٹ ورکس (ہومو ٹائپک اور ہیٹروٹائپک تعاملات دونوں کے ساتھ) اور پروٹین کے تعاملات کی کمزور نوعیت کی وجہ سے قطرہ قطرہ چارج توازن کو بہتر بنانے میں کم کارگر ہیں۔اس کے نتیجے میں بوندیں نکلتی ہیں جو طویل عرصے تک مائع رویے کو برقرار رکھتی ہیں اور ایک اعلی الیکٹرو اسٹیٹک سطح کی صلاحیت کو ظاہر کرتی ہیں جو کہ اکٹھا کرنے اور بڑھنے کے ذریعے کم سے کم ہوتی ہیں (اس طرح بوندوں کی سطح کے رقبہ/حجم کے تناسب کو کم سے کم کرتے ہیں) اور ہائیڈرو فیلک سطح کیم کو گیلا کرکے۔اس سے بڑی مرتکز پروٹین لائبریریاں بنتی ہیں جو سیال خصوصیات کو برقرار رکھتی ہیں کیونکہ پروٹین نیٹ ورک میں چارج کی اصلاح کی مسلسل تلاش کی وجہ سے تعاملات بہت عارضی رہتے ہیں۔دلچسپ بات یہ ہے کہ تاؤ کی N-ٹرمینل طور پر کٹی ہوئی شکلیں، جن میں کچھ قدرتی طور پر پائے جانے والے isoforms62 بھی شامل ہیں، درمیانی رویے کو ظاہر کرتے ہیں، کچھ coacervates αS کے ساتھ طویل عرصے تک جیل کی طرح کی بوندوں میں تبدیل ہوتے ہیں، جبکہ دیگر بڑے مائع کنڈینسیٹ میں تبدیل ہو جاتے ہیں۔αS electrostatic coacervates کی پختگی میں یہ دوہرا حالیہ LLPS نظریاتی اور تجرباتی مطالعات سے مطابقت رکھتا ہے جس نے کنڈینسیٹ کے سائز اور سیال کی خصوصیات کو کنٹرول کرنے کی کلید کے طور پر کنڈینسیٹس میں والینس کی کمی اور الیکٹرو اسٹیٹک چھلنی کے درمیان ارتباط کی نشاندہی کی ہے۔میکانزم 58.61۔
یہ اسکیم ایل ایل پی ایس اور ایل ایس پی ٹی کے ذریعے αS اور Tau441 کے لیے پوٹیٹیو امائلائیڈ ایگریگیشن پاتھ وے کو دکھاتی ہے۔اضافی اینیون سے بھرپور (سرخ) اور کیشن سے بھرپور (نیلے) خطوں کے ساتھ، تسلی بخش والینس کے ساتھ αS اور تاؤ الیکٹرو سٹیٹک کوسرویٹس میں سطح کی توانائی کم ہوتی ہے اور اس وجہ سے کم ہم آہنگی ہوتی ہے، جس کے نتیجے میں بوندوں کی تیزی سے عمر بڑھ جاتی ہے۔ایک مستحکم غیر جمع شدہ جیل کی حالت حاصل کی جاتی ہے۔.یہ صورتحال αS/pLK سسٹم کے معاملے میں بہت سازگار ہے کیونکہ اس کے اعلی تعلق اور آسان پروٹین جوڑے کے تعامل کے نیٹ ورک کی وجہ سے، جو جیل کی طرح تیزی سے منتقلی کی اجازت دیتا ہے۔اس کے برعکس، غیر تسلی بخش والینس والی بوندیں اور اس وجہ سے، بات چیت کے لیے دستیاب پروٹین سے چارج شدہ خطے، کوسرویٹ کے لیے ہائیڈرو فیلک سطح کو فیوز اور گیلا کرنا آسان بناتے ہیں تاکہ اس کی اعلی سطحی توانائی کو کم کیا جا سکے۔یہ صورتحال αS/Tau441 coacervates کے لیے بہتر ہے، جن کے پاس ایک کثیر الجہتی پیچیدہ نیٹ ورک ہے جس میں کمزور Tau-Tau اور αS-Tau تعاملات شامل ہیں۔اس کے نتیجے میں، بڑے کوسرویٹس آسانی سے اپنی سیال جیسی خصوصیات کو برقرار رکھیں گے، جس سے پروٹین سے پروٹین کے درمیان دیگر تعاملات رونما ہو سکیں گے۔آخر کار، امائلائیڈ متضاد مجموعے جس میں αS اور tau دونوں شامل ہوتے ہیں coacervate سیال کے اندر تشکیل پاتے ہیں، جن کا تعلق انکلیوشن باڈیز میں پائے جانے والوں سے ہو سکتا ہے، جو کہ نیوروڈیجینریٹیو بیماریوں کی علامت ہیں۔
αS/Tau441 کی پختگی کے دوران ایک انتہائی بھیڑ لیکن متحرک پروٹین ماحول کے ساتھ بڑے سیال نما ڈھانچے بنتے ہیں اور ایک حد تک، αS/ΔNt-Tau coacervates پروٹین کی جمع کے نیوکلیشن کے لیے مثالی ذخائر ہیں۔ہم نے واقعی اس قسم کے پروٹین کوسرویٹس میں ٹھوس پروٹین کے مجموعوں کی تشکیل کا مشاہدہ کیا ہے، جس میں اکثر αS اور tau دونوں ہوتے ہیں۔ہم نے دکھایا ہے کہ یہ ہیٹرو ایگریگیٹس غیر الیکٹروسٹیٹک تعاملات کے ذریعے مستحکم ہوتے ہیں، امائلائیڈ سے متعلق مخصوص ThT رنگوں کو اسی طرح باندھنے کے قابل ہوتے ہیں جس طرح عام امائلائیڈ فائبرلز، اور درحقیقت مختلف اثرات کے خلاف یکساں مزاحمت رکھتے ہیں۔LLPS کے ذریعہ بنائے گئے αS/tau مجموعوں میں amyloid جیسی خصوصیات دکھائی گئیں۔درحقیقت، امائلائیڈ ایگریگیشن میں تاؤ کی کمی کا پختہ تغیر مائع الیکٹرو سٹیٹک کوسرویٹ کے اندر ان متضاد αS مجموعوں کی تشکیل میں نمایاں طور پر خراب ہے۔αS/Tau441 مجموعوں کی تشکیل صرف coacervates کے اندر دیکھی گئی، جس نے مائع جیسی خصوصیات کو برقرار رکھا، اور کبھی نہیں، اگر coacervates/ droplets جیل کی حالت تک نہ پہنچیں۔مؤخر الذکر صورت میں، الیکٹرو اسٹاٹک تعاملات کی بڑھتی ہوئی طاقت اور اس کے نتیجے میں، پروٹین نیٹ ورک کی سختی امائلائیڈ نیوکلیشن کے لیے ضروری پروٹین کے نئے تعاملات کو قائم کرنے کے لیے پروٹین کی ضروری تعمیری ترتیب کو روکتی ہے۔تاہم، یہ زیادہ لچکدار، مائع نما coacervates میں حاصل کیا جا سکتا ہے، جس کے نتیجے میں مائع رہنے کا امکان زیادہ ہوتا ہے کیونکہ ان کے سائز میں اضافہ ہوتا ہے۔
یہ حقیقت کہ گاڑھا ہونے والے مرحلے کے اندر مجموعوں کی تشکیل چھوٹی بوندوں کی نسبت بڑی αS/Tau کنڈینسیٹس میں بہتر ہے جو تیزی سے جیل بنتی ہے، ان عوامل کی شناخت کی مطابقت کو نمایاں کرتی ہے جو بوندوں کے اتحاد کو کنٹرول کرتے ہیں۔اس طرح، نہ صرف مرحلے کی علیحدگی کا رجحان ہے، بلکہ مناسب کام کرنے کے ساتھ ساتھ بیماریوں سے بچاؤ کے لیے کنڈینسیٹ کے سائز کو بھی کنٹرول کیا جانا چاہیے۔58,61۔ہمارے نتائج αS/Tau نظام کے لیے LLPS اور LSPT کے درمیان توازن کی اہمیت کو بھی اجاگر کرتے ہیں۔جبکہ بوندوں کی تشکیل سنترپتی حالات کے تحت دستیاب پروٹین مونومر کی مقدار کو کم کرکے امائلائڈ جمع سے بچا سکتی ہے، جیسا کہ دوسرے نظاموں میں تجویز کیا گیا ہے 63,64، بوندوں کی اعلی سطح پر قطرہ کا فیوژن آہستہ ساختی دوبارہ ترتیب کے ذریعے اندرونی پروٹین کی جمع کا باعث بن سکتا ہے۔پروٹین نیٹ ورکس.
مجموعی طور پر، ہمارا ڈیٹا LSPT کے تناظر میں ڈراپ نیٹ ورکس میں ہم آہنگ والینس اور مطمئن/غیر مطمئن تعاملات کی مطابقت پر زور دیتا ہے۔خاص طور پر، ہم یہ ظاہر کرتے ہیں کہ مکمل طوالت کے αS/Tau441 کنڈینسیٹس مؤثر طریقے سے فیوز اور نیوکلیئٹ کرنے کے قابل ہیں تاکہ امائلائیڈ نما ہیٹرو ایگریگیٹس بنائیں جس میں دونوں پروٹین شامل ہیں اور ہمارے تجرباتی نتائج کی بنیاد پر ایک مالیکیولر میکانزم تجویز کرتے ہیں۔αS/Tau سیال coacervate میں دو پروٹینوں کی مشترکہ جمع جس کی ہم یہاں اطلاع دیتے ہیں درحقیقت شمولیت میں دو پروٹینوں کی مشترکہ لوکلائزیشن سے متعلق ہو سکتا ہے، جو کہ بیماری کی علامت ہیں، اور LLPS اور کے درمیان تعلقات کو سمجھنے میں معاون ثابت ہو سکتے ہیں۔ ایمیلائڈ ایگریگیشن، نیوروڈیجنریشن میں انتہائی چارج شدہ IDP کی راہ ہموار کرتا ہے۔
Monomeric WT-αS، cysteine ​​mutants (Q24C-αS، N122C-αS) اور ΔCt-αS متغیرات (Δ101-140) E. coli میں ظاہر کیے گئے تھے اور جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے صاف کیا گیا تھا۔ڈسلفائیڈ بانڈ کی تشکیل کو روکنے کے لیے αS سسٹین اتپریورتیوں کو صاف کرنے کے تمام مراحل میں 5 mM DTT شامل کیا گیا تھا۔Tau441 isoform (Adgene #16316 سے حاصل کردہ پلازمیڈ)، ΔNt-Tau ویرینٹ (Δ1–150، پرائمر CTTTAAGAAGGAGATACATGATCGCCACACGCGG، CATATGTATCCTCTCTCTTCTTAAAGTTAA53-variant) اور ΔTAAGTTAA53-variant GGCTC5 پرائمر کے ساتھ) ای کولی کلچرز تھے۔ 37°C اور 180 rpm پر OD600 = 0.6–0.7 تک بڑھ گیا، اور 37°C پر 3 گھنٹے کے لیے IPTG کے ساتھ اظہار کی حوصلہ افزائی کی گئی۔سیلز کو 11,500 xg پر 15 منٹ کے لیے 4 °C پر کٹائیں اور نمکین بفر سے دھوئیں جس میں 150 mM NaCl ہو۔لیسیز بفر میں گولی کو دوبارہ استعمال کریں (20 ملی لیٹر فی 1 ایل ایل بی: MES 20 mM، pH 6.8، NaCl 500 mM، EDTA 1 mM، MgCl2 0.2 mM، DTT 5 mM، PMSF 1 mM، benzamidine 50 μpe μpinM)۔سونیکیشن مرحلہ برف پر 10 دالوں کے لیے 80% کے طول و عرض کے ساتھ انجام دیا گیا تھا (1 منٹ آن، 1 منٹ آف)۔ایک الٹراساؤنڈ میں 60 ملی لیٹر سے زیادہ نہ ہوں۔E. coli lysates کو 95° C. پر 20 منٹ کے لیے گرم کیا گیا، پھر برف پر ٹھنڈا کیا گیا اور 40 منٹ کے لیے 127,000×g پر سینٹری فیوج کیا گیا۔واضح شدہ سپرنٹنٹ کا اطلاق 3.5 kDa جھلی (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, UK) پر کیا گیا تھا اور 4 L ڈائلیسس بفر (20 mM MES, pH 6.8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 m2 m2 mM) کے خلاف ڈائلائز کیا گیا تھا۔ ، PMSF 0.1 mM) 10 گھنٹے کے لیے۔ایک 5 ملی لیٹر کیشن ایکسچینج کالم (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, USA) کو ایکولبریشن بفر (20 mM MES, pH 6.8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, PFMS) کے ساتھ ہم آہنگ کیا گیا تھا۔Tau lysate کو 0.22 μm PVDF فلٹر کے ذریعے فلٹر کیا گیا تھا اور 1 ml/min کی بہاؤ کی شرح سے کالم میں انجکشن لگایا گیا تھا۔Elution بتدریج انجام دیا گیا، تاؤ کو 15–30% elution بفر (20 mM MES، pH 6.8، 1 M NaCl، 1 mM EDTA، 2 mM MgCl2، 2 mM DTT، 0.1 mM PMSF) کے ساتھ نکالا گیا۔کسروں کا تجزیہ SDS-PAGE کے ذریعے کیا گیا تھا، اور کسی بھی کسر کو جس میں ایک بینڈ کا متوقع مالیکیولر وزن تھا، کو 10 kDa سینٹری فیوج فلٹر کا استعمال کرتے ہوئے مرتکز کیا گیا تھا اور اس کی جگہ 10 mM HEPES، pH 7.4، NaCl 500 mM اور DTT mM پر مشتمل بفر کے ساتھ تبدیل کیا گیا تھا۔ حتمی پروٹین کی حراستی 100 μM تھی۔اس کے بعد پروٹین کے محلول کو 0.22 μm PVDF فلٹر سے گزارا گیا، جلدی سے منجمد اور -80 ° C پر محفوظ کیا گیا۔پروٹین K18 پروفیسر البرٹو بوفی نے مہربانی سے فراہم کی تھی۔تیاری کی پاکیزگی>95% تھی جیسا کہ SDS-PAGE اور MALDI-TOF/TOF سے تصدیق شدہ ہے۔مختلف سسٹینوں پر کیمیائی طور پر AlexaFluor488-maleimide (AF488، ThermoFisher Scientific، Waltham، MA, USA) یا TEMPOL-maleimide (Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada) کا لیبل لگایا گیا تھا۔جاذب اور مالدی ٹوف/ٹوف سے تصدیق کی گئی۔Tau441، ΔNt-Tau، AggDef-Tau اور K18 کو اسی طریقہ کار پر عمل کرتے ہوئے Atto647N-maleimide (ATTO-TEC GmbH، Siegen، Germany) کا استعمال کرتے ہوئے 191 اور 322 پوزیشنوں پر مقامی سسٹین کی باقیات کے ساتھ لیبل لگایا گیا تھا۔αS اور Tau441 کے لیے فی بقایا نقشے خالص چارج CIDER66 کا استعمال کرتے ہوئے بنائے گئے تھے۔
ٹھوس پولی-ایل-لائسین (سپلائر کی طرف سے NMR کے مطابق pLK DP 90-110، Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, USA) 10 mM HEPES، 100 mM NaCl، pH 7.4 سے 10 mM ارتکاز میں تحلیل کیا گیا تھا، عمل کے لیے سونیکیٹڈ الٹراسونک پانی کے غسل میں منٹ اور -20 ° C پر اسٹور کریں۔PEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, USA) اور FITC-dextran-500 (Sigma-Aldrich, Sant Louis, MI, USA) پانی میں حل پذیر ہیں اور LLPS بفر میں وسیع پیمانے پر تقسیم کیے جاتے ہیں۔ڈائیلاسز آلودہ نمکیات کو ہٹاتا ہے۔اس کے بعد انہیں 0.22 μm کے تاکنا سائز کے ساتھ ایک سرنج فلٹر کے ذریعے فلٹر کیا گیا تھا، اور ان کے ارتکاز کا حساب ریفریکٹومیٹر (میٹلر ٹولیڈو، کولمبس، اوہائیو، USA) کے ذریعے کیا گیا تھا۔ایل ایل پی ایس کے نمونے کمرے کے درجہ حرارت پر درج ذیل ترتیب میں تیار کیے گئے تھے: بفر اور اخراج کو ملایا گیا تھا اور 1 ایم ایم ٹرائس (2-کاربوکسیتھائل) فاسفائن (TCEP، کاربوسنتھ، کامپٹن، یو کے)، 1 ایم ایم 2,2,2,2- (ایتھین- 1, 2-diyldinitrile) tetraacetic acid (EDTA, carboxynth) اور 1% protease inhibitor (PMSF 100 mM, benzimide 1 mM, leupeptin 5 μM) کا مرکب۔پھر αS اور فیوزڈ پولی کیشنز (آپشنز pLK یا Tau) کو شامل کیا جاتا ہے۔thioflavin-T ٹائم سیریز کے تجربات (ThT، Carbosynth، Compton، UK) کے لیے، کل ThT ارتکاز کو αS کے نصف ہونے کے لیے استعمال کریں۔نرمی سے لیکن اچھی طرح مکس کریں تاکہ یہ یقینی بنایا جا سکے کہ وہ یکساں ہیں۔ہر جزو کا ارتکاز تجربہ سے تجربہ تک مختلف ہوتا ہے، جیسا کہ نتائج کے سیکشن میں بیان کیا گیا ہے۔Azide 0.02% (w/v) کے ارتکاز میں استعمال کیا گیا جب بھی تجربے کا دورانیہ 4 گھنٹے سے تجاوز کر گیا۔LLPS نمونوں کا استعمال کرتے ہوئے تمام تجزیوں کے لیے، تجزیہ سے پہلے 5 منٹ تک مرکب کو متوازن ہونے دیں۔روشنی بکھیرنے والے تجزیے کے لیے، 150 µl نمونے نان بائنڈنگ 96 ویل مائکرو پلیٹس (µClear®, Black, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Austria) پر لوڈ کیے گئے اور چپکنے والی فلم سے ڈھکے ہوئے تھے۔CLARIOstar پلیٹ ریڈر (BMG Labtech، Ortenberg، Germany) میں حل کے مرکز میں 350 nm پر جاذبیت کی پیمائش کرکے LLPs کی نگرانی کی گئی۔تجربات 25 ° C پر سہ رخی میں کئے گئے تھے، اور غلطیوں کو اوسط سے معیاری انحراف کے طور پر شمار کیا گیا تھا۔پتلا مرحلے کو نمونہ سینٹرفیوگریشن اور SDS-PAGE جیل تجزیہ کے ذریعہ مقدار میں طے کیا گیا تھا، اور مختلف LLPS حلوں میں پتلا اور مرتکز مراحل میں αS فریکشن کی مقدار درست کی گئی تھی۔ایک 100 μl LLPS نمونہ جس میں 1 μM AF488- لیبل والا αS تھا مکمل اختلاط کے ذریعے تیار کیا گیا تھا جس کے بعد 30 منٹ کے لئے 9600×g پر سینٹرفیوگریشن کیا گیا تھا، جس کے بعد عام طور پر بارش نظر آتی تھی۔SDS-PAGE جیل کا استعمال کرتے ہوئے پروٹین کوانٹیفیکیشن کے لئے سپرنٹنٹنٹ کا سب سے اوپر 50 μl استعمال کیا گیا تھا۔جیلوں کو ChemiDoc جیل امیجنگ سسٹم (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) کا استعمال کرتے ہوئے AF488 فلٹرز کے ساتھ اسکین کیا گیا یا Coomassie کے داغ سے داغ دیا گیا اور مناسب فلٹرز کے ساتھ تصور کیا گیا۔نتیجے میں بینڈوں کا تجزیہ امیج جے ورژن 1.53i (نیشنل انسٹی ٹیوٹ آف ہیلتھ، USA) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔تجربات ایک جیسے نتائج کے ساتھ دو مختلف تجربات میں ڈپلیکیٹ میں کئے گئے۔
عام طور پر، 150 μl نمونے نان بائنڈنگ 96 کنویں مائیکرو پلیٹس پر لگائے گئے تھے اور کمرے کے درجہ حرارت پر لائیکا DMI6000B الٹی مائکروسکوپ (لائیکا مائیکرو سسٹم، ویٹزلر، جرمنی) پر تصور کیے گئے تھے۔سپاٹ تجربات کے لیے، µ-Slide Angiogenesis پلیٹس (Ibidi GmbH، Gräfelfing، Germany) یا 96-well polystyrene microplates (Corning Costar Corp.، Acton، Massachusetts) بھی استعمال کیے گئے۔EL6000 ہالوجن یا مرکری میٹل ہالائیڈ لیمپ روشنی کے ذرائع کے طور پر استعمال کیے گئے تھے (بالترتیب BF/DIC اور WF امیجنگ کے لیے)۔ڈبلیو ایف مائیکروسکوپی کے لیے، نمونے پر روشنی کو فوکس کرنے اور اسے جمع کرنے کے لیے 40x میگنیفیکیشن ایئر مقصد (لائیکا مائیکرو سسٹم، جرمنی) استعمال کیا گیا۔AF488 اور ThT لیبل والے نمونوں کے لیے، معیاری GFP فلٹر سیٹ کے ساتھ اتیجیت اور اخراج کو فلٹر کریں، جوش اور اخراج بینڈ پاس فلٹرز، بالترتیب 460–500 nm اور 512–542 nm بینڈ پاس فلٹرز، اور ایک 495 nm dichro.Atto647N کے لیبل والے نمونوں کے لیے، جوش اور اخراج بینڈ پاس فلٹرز کے ساتھ Cy5 ​​فلٹرز کا ایک معیاری سیٹ بالترتیب 628–40 nm اور 692–40 nm، اور ایک 660 nm ڈائکروک آئینہ استعمال کیا گیا۔BF اور DIC مائیکروسکوپی کے لیے، ایک ہی عکاس روشنی جمع کرنے کا مقصد استعمال کریں۔جمع کردہ روشنی کو Leica DFC7000 CCD کیمرے (Leica Microsystems, Germany) پر ریکارڈ کیا گیا تھا۔نمائش کا وقت BF اور DIC مائکروسکوپی امیجنگ کے لیے 50 ms اور WF مائکروسکوپی امیجنگ کے لیے 20-100 ms تھا۔مقابلے کے لیے، ThT کے ساتھ تمام تجربات کے لیے نمائش کا وقت 100 ms تھا۔وقت گزر جانے کے تجربات بوندوں کے اتحاد کو دیکھنے کے لیے کیے گئے تھے، جس میں ہر 100 ایم ایس پر کئی منٹ کے لیے تصاویر جمع کی جاتی تھیں۔امیج جے (NIH، USA) کو تصویری تجزیہ کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔تجربات اسی طرح کے نتائج کے ساتھ سہ رخی میں کیے گئے تھے۔
اجتماعی تجربات، FRAP اور 3D تعمیر نو کے لیے، ZEN 2 بلیو ایڈیشن (Carl Zeiss AG، Oberkochen، Germany) کا استعمال کرتے ہوئے Zeiss LSM 880 inverted confocal microscope پر تصاویر حاصل کی گئیں۔50 µl کے نمونے µ-Slide Angiogenesis پیٹری ڈشز (Ibidi GmbH، Gröfelfing، جرمنی) پر لگائے گئے تھے، جن کا علاج ہائیڈرو فیلک پولیمر (ibiTreat) سے کیا گیا تھا اور اسے 63× تیل وسرجن مقصد میں نصب کیا گیا تھا DIC پر)۔458 nm، 488 nm، اور 633 nm آرگن لیزر لائنوں کا استعمال کرتے ہوئے تصاویر حاصل کی گئیں جن کی ریزولوشن 0.26 µm/pixel ہے اور 470–600–nm، 628nm، 628nm، 628nm کی اتیجیت اور اخراج کا پتہ لگانے والی ونڈوز کے لیے 8 µs/پکسل کا ایکسپوزر ٹائم۔ اور 638–755 nm بالترتیب ThT، AF488 اور Atto647N کو دیکھنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔FRAP تجربات کے لیے، ہر نمونے کی ٹائم لیپس فوٹو گرافی 1 فریم فی سیکنڈ پر ریکارڈ کی گئی۔تجربات اسی طرح کے نتائج کے ساتھ کمرے کے درجہ حرارت پر سہ رخی میں کیے گئے تھے۔تمام تصاویر کا تجزیہ زین 2 بلیو ایڈیشن سافٹ ویئر (کارل زیس اے جی، اوبرکوچن، جرمنی) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔FRAP منحنی خطوط کو نارملائز کیا گیا تھا، پلاٹ کیا گیا تھا اور اوریجن پرو 9.1 کا استعمال کرتے ہوئے Zen 2 کا استعمال کرتے ہوئے تصاویر سے نکالے گئے شدت/وقت کے ڈیٹا پر فٹ کیا گیا تھا۔وصولی کے منحنی خطوط کو ایک مونو ایکسپونینشل ماڈل میں لگایا گیا تھا تاکہ مالیکیولر ڈفیوژن کا حساب کتاب کیا جا سکے تاکہ حصول بلیچنگ اثر کو مدنظر رکھا جا سکے۔اس کے بعد ہم نے برائے نام بلیچنگ رداس اور پہلے سے طے شدہ بحالی نصف زندگی کا استعمال کرتے ہوئے D کا حساب لگایا جیسا کہ کانگ ایٹ ال کی مساوات میں ہے۔5 35 دکھایا گیا ہے۔
αS کی سنگل سیسٹین کی مختلف حالتوں کو 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL) کے ساتھ 24 (TEMPOL-24-αS) اور 122 (TEMPOL-122-αS) پوزیشنوں پر ترکیب کیا گیا تھا، بالترتیباسپن لیبلنگ EPR تجربات کے لیے، αS کا ارتکاز 100 μM پر سیٹ کیا گیا تھا اور PEG کا ارتکاز 15% (w/v) تھا۔جمع کرنے کے مختلف حالات کے لیے، αS:pLK کا تناسب 1:10 تھا، جبکہ αS:ΔNt-Tau اور αS:Tau441 کا تناسب 1:1 پر برقرار رکھا گیا تھا۔ہجوم کی غیر موجودگی میں ٹائٹریشن کے تجربات کے پابند ہونے کے لیے، TEMPOL-122-αS کو 50 μM پر برقرار رکھا گیا تھا اور پولی کیشنز کو بڑھتے ہوئے ارتکاز پر ٹائٹریٹ کیا گیا تھا، ہر حالت کو الگ سے تیار کیا گیا تھا۔CW-EPR پیمائش ایک Bruker ELEXSYS E580 X-band اسپیکٹومیٹر کا استعمال کرتے ہوئے کی گئی تھی جو Bruker ER4118 SPT-N1 ریزونیٹر سے لیس ہے جو ~ 9.7 GHz کی مائکروویو (SHF) فریکوئنسی پر کام کرتا ہے۔درجہ حرارت 25 ° C پر سیٹ کیا گیا تھا اور مائع نائٹروجن کریوسٹیٹ کے ذریعہ کنٹرول کیا گیا تھا۔سپیکٹرا غیر سیر شدہ حالات میں 4 میگاواٹ کی میگاواٹ پاور، 0.1 ایم ٹی کے ماڈیولیشن طول و عرض، اور 100 کلو ہرٹز کی ماڈیولیشن فریکوئنسی میں حاصل کیا گیا تھا۔Tau441 یا ΔNt-Tau (اصل پروٹین کے حل میں موجود) پر مشتمل نمونوں میں کم کرنے والے ایجنٹوں کی بقایا ارتکاز کی وجہ سے نمونوں اور ممکنہ اسپن میں کمی کے درمیان اسپن کی تعداد میں فرق سے بچنے کے لیے سپیکٹرل کی شدت کو معمول بنایا گیا تھا۔G کی دی گئی قدریں Matlab®67 میں نافذ Easyspin سافٹ ویئر (v. 6.0.0-dev.34) کا استعمال کرتے ہوئے EPR سپیکٹرل ماڈلنگ کے نتیجے میں حاصل کی گئیں۔ڈیٹا کو ماڈل کرنے کے لیے ایک/دو اجزاء کے آئیسوٹروپک ماڈل استعمال کیے گئے تھے۔تمام سگنلز کو معمول پر لانے کے بعد، باقیات کا حساب متعلقہ تجرباتی سپیکٹرم سے ہر نقلی کو گھٹا کر کیا گیا۔بائنڈنگ ٹائٹریشن تجزیہ کے لیے، نارملائزڈ EPR سپیکٹرم (IIII/III) کے دوسرے بینڈ سے تیسرے بینڈ کی نسبتہ شدت αS پر پولی کیشنز کے پابند ہونے کی نگرانی کے لیے استعمال کی گئی تھی۔انحطاط مستقل (Kd) کا اندازہ لگانے کے لیے، نتیجے میں آنے والے وکر کو n ایک جیسی اور آزاد بائنڈنگ سائٹس کو فرض کرتے ہوئے ایک اندازے کے ماڈل پر لگایا گیا تھا۔
NMR سپیکٹروسکوپی کے تجربات بروکر Neo 800 MHz (1H) NMR سپیکٹرو میٹر کا استعمال کرتے ہوئے کیے گئے تھے جو ایک کریوپروب اور Z-گریڈینٹ سے لیس تھا۔تمام تجربات 130–207 µM αS اور متعلقہ αS/ΔNt-Tau اور pLK کے مساوی 10 mM HEPES، 100 mM NaCl، 10% DO، pH 7.4 کا استعمال کرتے ہوئے کیے گئے اور 15 ° C پر کیے گئے۔NMR کے ذریعے LPS کی نگرانی کے لیے، پہلے سے مخلوط نمونوں میں 10% PEG شامل کیا گیا تھا۔کیمیکل شفٹ پرٹربیشن پلاٹ (تصویر 1b) اوسط 1H اور 15N کیمیائی شفٹوں کو ظاہر کرتا ہے۔αS 2D1H-15N HSQC سپیکٹرا سابقہ ​​تفویض (BMRB اندراج #25227) کی بنیاد پر تفویض کیا گیا تھا اور HNCA، HNCO اور CBCAcoNH کے 3D سپیکٹرا کو ریکارڈ کرنے اور تجزیہ کرکے اس کی تصدیق کی گئی تھی۔13Cα اور 13Cβ کیمیائی شفٹوں کا حساب ΔNt-Tau یا pLK کی موجودگی میں کیا گیا تاکہ ثانوی ڈھانچے کے رجحانات میں αS کیمیکل شفٹوں کے مقابلے میں خالص بے ترتیب کوائل کنفرمیشن 68 (ضمنی شکل 5c) میں ممکنہ تبدیلیوں کی پیمائش کی جا سکے۔R1ρ کی شرحیں 8، 36، 76، 100، 156، 250، 400، اور 800 ms کی تاخیر کے ساتھ hsqctretf3gpsi تجربات (بروکر لائبریری سے حاصل کردہ) ریکارڈ کر کے ناپی گئیں، اور کفایتی افعال کو مختلف اوقات میں تاخیر کی چوٹی میں ایڈجسٹ کیا گیا۔ R1ρ اور اس کی تجرباتی غیر یقینی صورتحال کا تعین کرنے کے اوقات۔
دو رنگوں کے وقت سے حل شدہ فلوروسینس مائکروسکوپی تجربات تجارتی وقت سے حل شدہ MT200 فلوروسینس کنفوکل مائکروسکوپ (PicoQuant، برلن، جرمنی) پر وقت سے منسلک سنگل فوٹوون گنتی (TCSPC) ڈیوائس کے ساتھ کیے گئے۔لیزر ڈائیوڈ ہیڈ کو pulsed interleaved excitation (PIE) کے لیے استعمال کیا جاتا ہے، شہتیر سنگل موڈ ویو گائیڈ سے گزرتا ہے اور اسے 481 nm اور 637 nm لیزر لائنوں کے لیے 10 سے 100 nW کی لیزر پاور سے جوڑا جاتا ہے جو ایک dichroic مرر کے بعد ماپا جاتا ہے۔یہ فوٹوون کی گنتی کی ایک بہترین شرح کو یقینی بناتا ہے، فوٹوون ایلائزنگ، فوٹو بلیچنگ اور سیچوریشن کے اثرات سے بچتا ہے۔μ-Slide angiogenesis coverslips یا پلیٹس (Ibidi GmbH، Gräfelfing، Germany) کو براہ راست ایک سپر اپوکرومیٹ 60x NA 1.2 لینس کے اوپر ایک اصلاحی کالر (Olympus Life Sciences, Waltham, USA) کے ساتھ وسرجن پانی میں رکھا گیا تھا۔ایک 488/640 nm dichroic آئینہ (Semrock, Lake Forest, IL, USA) کو مرکزی بیم سپلٹر کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔غیر مرکوز تابکاری کو 50 مائیکرون کے قطر والے سوراخ کے ذریعے روکا جاتا ہے، پھر فوکس شدہ تابکاری کو 50/50 بیم اسپلٹر کے ذریعے 2 پتہ لگانے والے راستوں میں تقسیم کیا جاتا ہے۔بینڈ پاس کے اخراج کے فلٹرز (سیمروک، لیک فاریسٹ، IL، USA) گرین ڈائی (AF488) کے لیے 520/35 اور ریڈ ڈائی (Atto647N) کے لیے 690/70 ڈیٹیکٹر کے سامنے استعمال کیے گئے۔سنگل فوٹون برفانی تودہ ڈایڈس (SPAD) (مائیکرو فوٹون ڈیوائسز، بولزانو، اٹلی) کو ڈیٹیکٹر کے طور پر استعمال کیا گیا۔ڈیٹا اکٹھا کرنا اور تجزیہ دونوں تجارتی طور پر دستیاب SymphoTime64 سافٹ ویئر (PicoQuant GmbH، برلن، جرمنی) کا استعمال کرتے ہوئے کیے گئے۔
ایل ایل پی ایس کے نمونوں کے پچاس مائیکرو لیٹرز μ-Slide angiogenesis Wells (Ibidi GmbH، Gräfelfing، Germany) پر لگائے گئے تھے۔نتیجے میں آنے والی تصاویر کو معطل شدہ بوندوں کے لیے زیادہ سے زیادہ معروضی کام کے فاصلے کے لیے کنویں کے نیچے سے 20 µm اوپر اور کم از کم 0.25 µm/pixel کے محوری ریزولوشن کے ساتھ رافٹس اور نقطوں کے لیے ~1 µm تک اور 400 µs/پکسل کی تاخیر کا وقت ہے۔ہر چینل کے لیے اوسط بیک گراؤنڈ سگنل کی شدت (PBG، مطلب + 2σ) کی بنیاد پر شدت کی حد کا اطلاق کرتے ہوئے ڈیٹا کا انتخاب کریں تاکہ منتشر ہونے والے مرحلے سے کسی بھی ممکنہ اصل کو فلٹر کرتے ہوئے صرف مائع پروٹین کی بوندوں، رافٹس یا دھبوں کا انتخاب کیا جائے۔ہر چینل کی ہر پرجاتی (τ) کی عمر کا تجزیہ کرنے کے لیے (سبز، AF488 کے لیے "g" اور سرخ، Atto647N کے لیے "r")، ہم نے دلچسپی کے علاقوں (ROIs) کا انتخاب کیا جن میں بوندوں، رافٹس، یا دھبوں پر مشتمل ہے (ضمنی شکل 1 )۔8b) اور ہر چینل میں ٹیل فٹ تجزیہ اور دو اجزاء کے کشی ماڈل کا استعمال کرتے ہوئے ان کی زندگی بھر کی کشی (τD، τR اور τP بوندوں، رافٹس یا دھبوں کے لیے بالترتیب، ضمنی شکل 8c دیکھیں) کو فٹ کر کے اخذ کیا۔اوسط τ سے τ ۔ROIs جنہوں نے ملٹی ایکسپونینشل فٹ کے لیے بہت کم فوٹون تیار کیے تھے ان کو تجزیہ سے خارج کر دیا گیا تھا۔استعمال شدہ کٹ آف رافٹس اور نقطوں کے لیے <104 فوٹون اور قطروں کے لیے 103 تھا۔بوندوں کی حد کم ہوتی ہے کیونکہ زیادہ شدت والی قدروں کے ساتھ کشی کے منحنی خطوط حاصل کرنا مشکل ہوتا ہے، کیونکہ تصویر کے میدان میں قطرے عام طور پر چھوٹے اور کم متعدد ہوتے ہیں۔فوٹوون جمع کرنے کی حد سے اوپر فوٹوون کی گنتی والے ROIs (>500 کاؤنٹ/پکسل پر سیٹ) کو بھی تجزیہ کے لیے مسترد کر دیا گیا۔سروس لائف کے آغاز سے ہی دلچسپی کے علاقے سے حاصل کردہ شدت کے کشی کے منحنی خطوط کو زیادہ سے زیادہ 90٪ (زیادہ سے زیادہ کشی کی شدت کے بعد) کی شدت کے ساتھ میچ کریں تاکہ کم سے کم IRF مداخلت کو یقینی بنایا جا سکے جبکہ تمام شدت کے زوال کے لیے اسی کو برقرار رکھتے ہوئے سیٹنگز متعلقہ ٹائم ونڈو کا تجزیہ کیا گیا 25 سے 50 ROI رافٹس اور اسپاٹس کے لیے اور 15-25 ROI قطروں کے لیے، کم از کم 3 آزاد تجربوں سے ریکارڈ کی گئی 4 سے زیادہ نقلوں سے منتخب کردہ تصاویر۔پرجاتیوں کے درمیان یا coacervate نظاموں کے درمیان شماریاتی فرق کو جانچنے کے لیے دو دم والے ٹی ٹیسٹ کا استعمال کیا گیا ہے۔زندگی بھر کے پکسل بہ پکسل تجزیہ کے لیے (τ)، ہر چینل کے لیے فیلڈ کے دوران زندگی بھر کی کل کشندگی کا حساب لگایا گیا اور 2/3-جزوں کی کفایت شعاری کے ماڈل کا تخمینہ لگایا گیا۔اس کے بعد ہر پکسل کے لئے زندگی بھر کی کشیدگی کو پہلے سے حساب شدہ τ اقدار کا استعمال کرتے ہوئے لگایا گیا تھا، جس کے نتیجے میں سیوڈو کلر FLIM فٹ امیج بنتا ہے۔ایک ہی چینل کی تمام امیجز میں ٹیل فٹ لائف ٹائم رینج یکساں تھی، اور ہر زوال نے قابل اعتماد فٹ فراہم کرنے کے لیے کافی فوٹون تیار کیے تھے۔FRET تجزیہ کے لیے، پکسلز کا انتخاب 100 فوٹونز کی کم شدت کی حد کو لگا کر کیا گیا، جس کا اوسطاً 11 فوٹون کا بیک گراؤنڈ سگنل (FBG) تھا۔ہر چینل کی فلوروسینس کی شدت تجرباتی طور پر طے شدہ اصلاحی عوامل کے ذریعہ درست کی گئی تھی: 69 اسپیکٹرل کراسسٹالک α 0.004 تھا، براہ راست جوش β 0.0305 تھا، پتہ لگانے کی کارکردگی γ 0.517 تھی۔پکسل کی سطح پر FRET کی کارکردگی پھر درج ذیل مساوات کا استعمال کرتے ہوئے شمار کی جاتی ہے۔
جہاں FDD فلوروسینس کی شدت ہے جو ڈونر (گرین) چینل میں مشاہدہ کی جاتی ہے، FDA وہ فلوروسینس کی شدت ہے جو قبول کنندہ (سرخ) چینل میں بالواسطہ اتیجیت کے تحت دیکھی جاتی ہے، اور FAA وہ فلوروسینس کی شدت ہے جو قبول کنندہ (سرخ) چینل میں براہ راست حوصلہ افزائی کے تحت مشاہدہ کی جاتی ہے۔ PIE)۔چینل میں فلوروسینس کی شدت کی دالیں دیکھی جاتی ہیں)۔
ایل ایل پی ایس بفر میں 100 µl ایل ایل پی ایس ری ایکشن سلوشنز جس میں 25 µM بغیر لیبل والے مونومیرک Tau441 (25 µM αS کے ساتھ یا اس کے بغیر) چپکنے والی ورق کی کوٹنگ کے ساتھ نان بائنڈنگ 96 کنویں مائیکرو پلیٹس پر رکھیں اور مائیکرو پلیٹ فارم کے بعد WF کو چیک کیا گیا۔ توازن10 منٹ کے اندرکمرے کے درجہ حرارت پر انکیوبیشن کے 48 گھنٹے کے بعد، پروٹین رافٹس اور دھبوں کی موجودگی کی تصدیق ہوئی۔پھر احتیاط سے کنویں سے رافٹس کے اوپر سے مائع کو ہٹا دیں، پھر 50 L dissociation buffer (10 mM HEPES، pH 7.4، 1 M NaCl، 1 mM DTT) شامل کریں اور 10 منٹ تک انکیوبیٹ کریں۔نمک کا زیادہ ارتکاز اس بات کو یقینی بناتا ہے کہ بقایا پی ای جی کی وجہ سے ایل ایل پی ایس دہرایا نہیں جائے گا، اور صرف الیکٹرو اسٹاٹک تعاملات کے ذریعے بننے والی ممکنہ پروٹین اسمبلیوں کو الگ کر دیا جائے گا۔اس کے بعد کنویں کے نچلے حصے کو مائیکرو پیپٹ ٹپ کے ساتھ احتیاط سے کھرچ دیا گیا اور اس کے نتیجے میں حل کو خالی مشاہداتی کنویں میں منتقل کر دیا گیا۔1 گھنٹہ کے لیے 50 μM ThT کے ساتھ نمونوں کے انکیوبیشن کے بعد، WF مائکروسکوپی کے ذریعے الگ تھلگ دھبوں کی موجودگی کی جانچ کی گئی۔پی بی ایس میں پی ایچ 7.4 کے ساتھ 70-µM αS محلول کے 300 µl، 37 °C پر سوڈیم ایزائیڈ 0.01% اور ایک مداری شیکر پر 200 rpm کو 7 دنوں تک انکیوبیٹ کرکے سونیکیٹڈ αS فائبرلز تیار کریں۔اس کے بعد محلول کو 9600×g پر 30 منٹ کے لیے سینٹری فیوج کیا گیا، گولی کو PBS pH 7.4 میں دوبارہ بند کر دیا گیا اور سونیکیٹ کیا گیا (1 منٹ، 50% سائیکل، 80% طول و عرض وائبرا سیل VC130 سونیکیٹر میں، Sonics, Newton, USA) fibril سیمپل چھوٹے فائبروں کی نسبتاً یکساں سائز کی تقسیم کے ساتھ۔
FCS/FCCS تجزیہ اور دو رنگوں کے اتفاق کا پتہ لگانے (TCCD) PIE موڈ کا استعمال کرتے ہوئے FLIM-FRET مائکروسکوپی تجربات کے لئے استعمال ہونے والے اسی MT200 ٹائم حل شدہ فلوروسینٹ کنفوکل مائکروسکوپ (پیکو-کوانٹ، برلن، جرمنی) پر انجام دیا گیا تھا۔ان تجربات کے لیے لیزر پاور کو 6.0 µW (481 nm) اور 6.2 µW (637 nm) میں شامل کیا گیا۔ان لیزر طاقتوں کے امتزاج کا انتخاب فلوروفورس کے جوڑوں کے لیے اسی طرح کی چمک پیدا کرنے کے لیے کیا گیا تھا جب کہ زیادہ سے زیادہ گنتی کی شرحوں کو حاصل کرتے ہوئے اور فوٹو بلیچنگ اور سنترپتی سے گریز کیا گیا تھا۔ڈیٹا اکٹھا کرنا اور تجزیہ دونوں تجارتی طور پر دستیاب SymphoTime64 ورژن 2.3 سافٹ ویئر (PicoQuant، Berlin، Germany) کا استعمال کرتے ہوئے کیے گئے۔
LLPS کا استعمال کرتے ہوئے حاصل کیے گئے الگ تھلگ αS/Tau ایگریگیٹس کے نمونوں کو الگ تھلگ بفر میں مناسب مونومولیکولر ارتکاز (عام طور پر 1:500 ڈیلیشن، کیونکہ مجموعات پہلے ہی کم ارتکاز پر ہوتے ہیں جب coacervate نمونوں سے الگ تھلگ ہوتے ہیں)۔نمونے براہ راست کور سلپس (کارننگ، یو ایس اے) پر 1 ملی گرام/ملی لیٹر کے ارتکاز میں بی ایس اے کے حل کے ساتھ پیش کیے گئے تھے۔
سبز اور سرخ چینلز میں PIE-smFRET تجزیہ کے لیے، monomeric واقعات کی وجہ سے کم شدت والے سگنلز کو فلٹر کرنے کے لیے 25 فوٹونز کی کم شدت کی حد کا اطلاق کیا گیا تھا (نوٹ کریں کہ الگ تھلگ مجموعوں کے مقابلے میں monomers کی تعداد مجموعی نمونوں سے زیادہ ہے)۔اس حد کا حساب خالص مونومر نمونوں کے تجزیے سے حاصل کردہ monomeric αS کی اوسط شدت سے پانچ گنا لگایا گیا تھا تاکہ تجزیہ کے لیے خاص طور پر مجموعوں کو منتخب کیا جا سکے۔PIE ڈرائیو سرکٹ، TSCPC ڈیٹا کے حصول کے ساتھ، زندگی بھر کے وزن کے فلٹر کے اطلاق کو قابل بناتا ہے جو پس منظر اور اسپیکٹرل کراسسٹالک کو ختم کرنے میں مدد کرتا ہے۔مندرجہ بالا دہلیز کا استعمال کرتے ہوئے منتخب کردہ بھڑک اٹھنے کی شدت کو صرف بفر کے نمونوں کی شدت/بن کے مقابلے وقوع کے ہسٹوگرامس سے متعین اوسط بیک گراؤنڈ سگنل کا استعمال کرتے ہوئے درست کیا گیا تھا۔بڑے ایگریگیٹس کے ساتھ وابستہ برسٹ عام طور پر ٹائم ٹریس (1 ms پر سیٹ) میں لگاتار کئی ڈبوں پر قبضہ کرتے ہیں۔ان صورتوں میں، زیادہ سے زیادہ طاقت کا ایک ڈبہ منتخب کیا گیا تھا۔FRET اور stoichiometric تجزیہ کے لیے، نظریاتی طور پر طے شدہ گاما فیکٹر γ (0.517) استعمال کیا گیا تھا۔اسپیکٹرل کراسسٹالک اور براہ راست اتیجیت شراکتیں نہ ہونے کے برابر ہیں (تجرباتی طور پر طے شدہ) جوش لیزر پاور استعمال کی جاتی ہیں۔ایک دھماکے میں FRET کی کارکردگی اور سٹوچیومیٹری کا حساب درج ذیل ہے۔