310 10*1 ملی میٹر سٹینلیس سٹیل کوائلڈ نلیاں کیمیکل پرزنٹ، سپائیڈروئن کے N-ٹرمینل ڈومینز امائلائیڈ فائبرز پر مبنی ہائیڈروجلز بناتے ہیں اور پروٹین کو متحرک کرنے کے لیے ایک پلیٹ فارم فراہم کرتے ہیں۔

Nature.com پر جانے کا شکریہ۔آپ محدود سی ایس ایس سپورٹ کے ساتھ براؤزر کا ورژن استعمال کر رہے ہیں۔بہترین تجربے کے لیے، ہم تجویز کرتے ہیں کہ آپ ایک اپ ڈیٹ شدہ براؤزر استعمال کریں (یا انٹرنیٹ ایکسپلورر میں مطابقت موڈ کو غیر فعال کریں)۔اس کے علاوہ، جاری تعاون کو یقینی بنانے کے لیے، ہم سائٹ کو بغیر اسٹائل اور جاوا اسکرپٹ کے دکھاتے ہیں۔
سلائیڈرز فی سلائیڈ تین مضامین دکھا رہے ہیں۔سلائیڈوں کے ذریعے جانے کے لیے پیچھے اور اگلے بٹنوں کا استعمال کریں، یا ہر سلائیڈ سے گزرنے کے لیے آخر میں سلائیڈ کنٹرولر بٹن استعمال کریں۔

تفصیلات

310 10*1mm سٹینلیس سٹیل کوائلڈ نلیاں فراہم کرنے والے

کیمیائی ساخت

مشینی خصوصیات

ریکومبیننٹ اسپائیڈر سلک پروٹین (مکڑی سلک پروٹین) میں نئے بائیو میٹریلز کی نشوونما میں بہت سے ممکنہ استعمال ہوتے ہیں، لیکن ان کی ملٹی موڈل اور ایگریگیشن کا شکار نوعیت انہیں حاصل کرنا مشکل اور استعمال میں آسان بناتی ہے۔یہاں ہم رپورٹ کرتے ہیں کہ ریکومبیننٹ چھوٹے اسپائیڈروئن پروٹینز اور اہم بات یہ ہے کہ N-ٹرمینل ڈومین (NT) خود ہی تیزی سے 37 ° C پر خود معاون اور شفاف ہائیڈروجلز تشکیل دیتے ہیں۔NT اور گرین فلوروسینٹ پروٹین یا purine nucleoside phosphorylase پر مشتمل فیوژن پروٹین مکمل طور پر فعال فیوژن پروٹین بناتے ہیں۔ہائیڈروجلز۔ہمارے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ ریکومبیننٹ NT اور فیوژن پروٹین اعلی اظہار کی پیداوار فراہم کرتے ہیں اور ہائیڈروجلز کو پرکشش خصوصیات کے ساتھ عطا کرتے ہیں جیسے شفافیت، بغیر کسی کراس لنکنگ کے جیلیشن، اور اعلی کثافت پر فعال پروٹین کا براہ راست متحرک ہونا۔
مکڑیوں میں ریشم کے غدود کے سات مختلف سیٹ ہوتے ہیں، جن میں سے ہر ایک مخصوص قسم کا ریشم پیدا کرتا ہے۔ریشم کی تمام سات انواع مکڑی کے سلک پروٹینز (اسپائیڈروئنز) پر مشتمل ہیں جو تقریباً 6000 اوشیشوں لمبے ہیں اور اس میں کروی N- اور C-ٹرمینل ڈومینز (NT اور CT) 1,2 سے گھرا ہوا ایک بڑا مرکزی ریپیٹ خطہ ہے۔ریشم کی سب سے زیادہ مطالعہ کی جانے والی قسم، پرائمری امپولا، پرائمری امپولا غدود کے ذریعے تیار کی جاتی ہے۔اس غدود میں، اپکلا خلیات کا ایک monolayer spidroin پروٹین کی ترکیب کرتا ہے اور انہیں غدود کے lumen میں چھپاتا ہے، جہاں وہ انتہائی زیادہ ارتکاز (30-50% w/v) 3,4 میں حل پذیر شکل (ڈوپنگ) میں موجود ہوتے ہیں۔غدود میں مرکزی امپولر اسپائیڈروئن پروٹین کی تنظیم اور تشکیل پر بحث ہوتی رہی ہے، لیکن زیادہ تر تجرباتی شواہد عام طور پر ہیلیکل اور/یا بے ترتیب ہیلیکل کنفارمیشن اور مائکیلر یا لیملر ڈھانچے 5,6,7,8,9,10 کی موجودگی کی نشاندہی کرتے ہیں۔جب کہ دہرائے جانے والے ڈومینز ریشم کے ریشوں کی میکانکی خصوصیات کو منظم کرتے ہیں، β-شیٹ نانو کرسٹلز اور بے ساختہ ڈھانچے کی تشکیل کرتے ہیں 11,12,13,14,15، اختتامی ڈومینز ریشم کے غدود کے ساتھ بدلتے ہوئے حالات کے جواب میں ریشم کے ریشوں کو ریگولیٹ کرتے ہیں 16,17,18۔ریشم کی تشکیل کو کنٹرول کرکے، 19. ٹرمینل ڈومینز ارتقائی طور پر محفوظ ہیں اور ان کا کام تمام اسپائیڈروئن پروٹین 2,20,21 میں عام ہوسکتا ہے۔غدود سے گزرنے کے دوران، اسپائیڈروئن کا پی ایچ تقریباً 7.6 سے <5.716 تک کم ہو جاتا ہے اور دھیرے دھیرے تنگ ہونے والی نالی کے ذریعے حرکت کے ذریعے قینچ اور کھینچنے کے ساتھ بڑھتا ہے۔حل میں، CT ایک α-ہیلیکل تشکیلاتی متوازی dimer17 ہے، لیکن کم pH اور قینچ والی قوتوں کے جواب میں، CT β-layers16, 17 کو کھولتا اور سوئچ کرتا ہے، ممکنہ طور پر کنورٹ 16 کے دہرائے جانے والے علاقوں میں β-پرتوں کو متحرک کرتا ہے۔ NT monomeric ہیں ایسی حالتیں جو غدود کے لیمن میں حالات کی عکاسی کرتی ہیں اور اسپائیڈروئن کی حل پذیری میں ثالثی کرتی ہیں، لیکن پی ایچ کم ہونے پر، کاربو آکسیلک ایسڈ سائیڈ چینز کی ایک بڑی تعداد کا پروٹونیشن تقریباً 6.5 کے pKa کے ساتھ NT کے dimerization کا باعث بنتا ہے، اس طرح NT کو مستحکم کرتا ہے اور اسپائیڈروئن کو بڑے پیمانے پر ٹھیک کرتا ہے۔ مقداریںنیٹ ورک 16,18۔اس طرح، NT تنت کی تشکیل میں کلیدی کردار ادا کرتا ہے، کوٹنگ میں ایک مونومر سے فائبر 23,24,25 میں ڈائمر میں تبدیل ہوتا ہے۔NT تاریخ 16، 18، 19، 20، 26، 27، 28، 29 تک زیر مطالعہ تمام حالات میں انتہائی حل پذیر اور ہیلیکل رہتا ہے، جس نے ہیٹرولوجس پروٹین کی تیاری کے لیے حل پذیری بڑھانے والے لیبل کے طور پر اس کی ترقی کو متاثر کیا۔
ریکومبیننٹ منی اسپائیڈر سلک پروٹین، جس میں ایک NT، ایک شارٹ ریپیٹ ریجن، ایک CT، اور ایک His6 ٹیگ (His-NT2RepCT) شامل ہے، آبی بفر میں اتنا ہی گھلنشیل ہے جتنا مقامی مکڑی سلک پروٹین اور ریشم مکڑی کی مقامی اہم خصوصیات کی نقل کرتا ہے۔ .کوریج 25.31۔His-NT2RepCT کو بایومیمیٹک مشین کا استعمال کرتے ہوئے مسلسل ریشوں میں کاتا جا سکتا ہے جس میں pH 8 حل پذیر کوٹنگ کو پی ایچ 525,32,33,34,35 پانی کے غسل میں نکالا جاتا ہے۔E. coli کا بائیو ری ایکٹر ابال جو His-NT2RepCT کا اظہار کرتا ہے اور اس کے بعد کے علاج کے نتیجے میں طہارت کے بعد> 14 g/L پیداوار حاصل ہوتی ہے۔تیزابیت والے حالات کے لیے His-NT2RepCT کا اعلیٰ پیداوار، اعلیٰ حل پذیری اور مناسب ردعمل سبھی NT23، 25، 34 سے منسوب ہیں۔
یہاں ہم 37 ° C پر ایک پروٹین محلول کو انکیوبیٹ کرکے صرف NT سمیت ریکومبیننٹ اسپائیڈروئن پروٹین سے شفاف ہائیڈروجلز کی تیزی سے تشکیل کی اطلاع دیتے ہیں۔تھیو فلاوین ٹی فلوروسینس (ThT)، فوئیر ٹرانسفارم انفراریڈ اسپیکٹروسکوپی (FTIR)، نیوکلیئر میگنیٹک ریزوننس اسپیکٹروسکوپی (NMR) اور ٹرانسمیشن الیکٹران مائیکروسکوپی (TEM) کا استعمال کرتے ہوئے، ہم نے پایا کہ NT اور مائکرو اسپائیڈر پروٹین ساختی تبدیلی سے گزرتے ہیں β-sheets اور amyloid-like fibrils میں۔ جب جیلیں بنتی ہیں۔اس کے علاوہ، NT اور گرین فلوروسینٹ پروٹین (GFP) یا purine nucleoside phosphorylase (PNP) کے فیوژن پروٹین مکمل طور پر فعال فیوژن ٹکڑوں کے ساتھ ہائیڈروجلز بناتے ہیں۔ہیٹرولوگس میزبانوں میں ہائی تھرو پٹ اظہار، جسمانی حالات میں ہائیڈروجلز کی تیزی سے تشکیل کے ساتھ، انجنیئرڈ فنکشنز کے ساتھ ہائیڈروجلز کی لاگت سے موثر پیداوار کے امکان کو کھولتا ہے۔
سب سے زیادہ اطلاع دی گئی ریکومبیننٹ اسپائیڈروئن پروٹینز کے برعکس، His-NT2RepCT Tris-HCl بفر میں pH 8 پر مستحکم ہے اور بغیر کسی بارش کے 500 mg/mL تک مرکوز کیا جا سکتا ہے۔لہٰذا، ہمیں یہ جان کر حیرت ہوئی کہ یہ پروٹین تیزی سے بصری طور پر واضح، خود کی مدد کرنے والے ہائیڈروجلز بنتا ہے جب 37 ° C (تصویر 1b-d) پر انکیوبیٹ کیا جاتا ہے۔مزید مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ His-NT2RepCT جیلیشن پروٹین کے ارتکاز کی ایک وسیع رینج (10–300 mg/mL) پر واقع ہوا ہے اور یہ کہ یہ ارتکاز جیلیشن کے وقت کے ساتھ الٹا تعلق ہے (تصویر 1c اور ضمنی شکل 1)۔یہ معلوم کرنے کے لیے کہ His-NT2RepCT کے کون سے حصے ہائیڈروجل کی تشکیل میں ثالثی کرتے ہیں، پھر ہم نے فلاسک الٹا پرکھ (شکل 1a، b) کا استعمال کرتے ہوئے ہر ڈومین کو انفرادی طور پر اور مختلف مجموعوں میں جانچا۔ریکومبیننٹ اسپائیڈروئن کے تمام آزمائشی حصوں نے 1 گھنٹے سے بھی کم وقت میں جیل (300 mg/mL کی پروٹین کی مقدار میں) بنائی، سوائے 2Rep (تصویر 1b) کے۔اس سے پتہ چلتا ہے کہ اکیلے NT اور CT، مجموعہ میں، یا دہرانے کے ساتھ منسلک، 37 ° C پر جیل کر سکتے ہیں اور His6 ٹیگ اس عمل کو کسی خاص حد تک متاثر نہیں کرتا ہے۔عام خیال کو دیکھتے ہوئے کہ NT ایک انتہائی حل پذیر اور مستحکم پروٹین ہے، اور یہ کہ ریکومبیننٹ اسپائیڈروئن ہائیڈروجلز کی پچھلی رپورٹوں نے دہرائے جانے والے خطوں اور/یا CTs میں تعمیری تبدیلیوں سے جیلیشن اثرات کو منسوب کیا ہے، NT خود بھی کر سکتا ہے۔جیلیشن کی دریافت غیر متوقع تھی۔ضمنی جدول 1) 37, 38, 39۔ قابل ذکر بات یہ ہے کہ NT پہلے ہی 10 منٹ کے اندر ≥ 300 mg/mL (تصویر 1c) کے ارتکاز میں جیل ہو چکا ہے۔NT کے مختلف ارتکاز کے ساتھ شیشی الٹنے کے تجربات سے پتہ چلتا ہے کہ 50 mg/mL پر NT محلول His-NT2RepCT سے زیادہ تیزی سے اسی ارتکاز (w/v، شکل 1c) پر نکلتا ہے۔
اس کام میں مطالعہ کی گئی مختلف اسپائیڈروئن تعمیرات کی منصوبہ بندی کی نمائندگی۔b جیل کا وقت 37 ° C پر مختلف ریکومبیننٹ اسپائیڈروئن پروٹین (300 mg/mL) کے لیے شیشی کو الٹ کر تصدیق کی جاتی ہے۔انکیوبیشن کے بغیر فوری طور پر CT جیل (<300 mg/mL)، 2Rep precipitates (300 mg/mL، 5 mm پیمانے)۔c His-NT2RepCT اور NT کا جیل ٹائم 37 ° C پر اشارہ شدہ پروٹین کی تعداد میں۔d مکڑی کے ساتھ His-NT2RepCT اور NT ہائیڈروجلز کی تصاویر اور نیچے بالترتیب "NT" کا حرف چھپا ہوا ہے (دونوں 200 mg/mL، اسکیل بار 5 mm)۔
مختلف ریکومبیننٹ اسپائیڈروئن پروٹینوں کے ذریعے بننے والے ہائیڈروجیلز کے رنگ قدرے مختلف ہوتے ہیں، اور ننگی آنکھوں کا مشاہدہ شفافیت کی مختلف ڈگریوں کو ظاہر کرتا ہے (تصویر 1b)۔NT جیل غیر معمولی طور پر واضح ہوتے ہیں جبکہ دیگر جیل مبہم ہو جاتے ہیں۔بیلناکار ٹیوبوں میں ڈالے جانے والے His-NT2RepCT اور NT جیلوں کو مولڈ سے برقرار رکھا جا سکتا ہے (تصویر 1d)۔
یہ جانچنے کے لیے کہ آیا قدرتی مکڑی کے ریشم کی کوٹنگز جیل اب حالات میں دوبارہ پیدا ہونے والے اسپائیڈروئن پروٹین کی جلن کا سبب بنتی ہیں، سویڈش برج اسپائیڈر (لارینیوئڈس اسکلوپیٹیریئس) کے بڑے امپولا غدود سے کوٹنگز جمع کی گئیں۔کوٹنگز کو 20 mM Tris-HCl بفر میں 50 mg/mL پر ذخیرہ کیا گیا تھا (ماپے ہوئے خشک وزن کی بنیاد پر)، لیکن 37 ° C (ضمنی شکل 2a) پر 21 دن کے انکیوبیشن کے دوران کوئی جیلیشن نہیں دیکھا گیا۔
ان جیلوں کی مقدار درست کرنے کے لیے، rheological پیمائش کو جیلیشن کے عمل کا مطالعہ کرنے اور مجموعی میکانکی خصوصیات کا تعین کرنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔خاص طور پر، بلند درجہ حرارت پر سٹوریج ماڈیولس (لچک) کی نگرانی جیلنگ کے درجہ حرارت کے ساتھ ساتھ کوٹنگ کی ویسکوئلاسٹک خصوصیات کے بارے میں معلومات فراہم کر سکتی ہے۔درجہ حرارت میں اضافے کے تجربات (1°C/منٹ 25-45°C پر استعمال کرتے ہوئے، قدرتی سلک اسٹاک سلوشنز کا استعمال کرتے ہوئے پچھلے مطالعات کی بنیاد پر) 40,41 سے پتہ چلتا ہے کہ بڑھتے ہوئے درجہ حرارت کے ساتھ His-NT2RepCT اور NT سلوشنز کے اسٹوریج موڈیولی میں اضافہ ہوا ہے۔اضافہ کیا گیا تھا (تصویر 2 اور ضمنی شکل 3)۔خاص طور پر، NT ماڈیول His-NT2RepCT کے مقابلے میں کم درجہ حرارت پر بڑھنا شروع ہوا، جو تیز جیل کے وقت کے مطابق دیکھا گیا جب NT کو براہ راست His-NT2RepCT کے ساتھ 37 ° C (شکل 1) پر لگایا گیا تھا۔بعد میں درجہ حرارت میں کمی کے بعد، اسٹوریج ماڈیولس کم قدروں پر واپس نہیں آیا اور نقصان کے ماڈیولس سے اوپر رہا (دیکھیں ضمنی شکل 3)، جو تھرمل طور پر ناقابل واپسی مستحکم جیلیشن کی نشاندہی کرتا ہے۔جیلیشن کے بعد، حتمی لچکدار ماڈیولس His-NT2RepCT ہائیڈروجلز کے لیے 15 سے 330 kPa تک 100–500 mg/mL کے ارتکاز میں، اور NT ہائیڈروجلز (100–500 mg/mL) کے لیے حتمی لچکدار ماڈیولس 00-2 سے 2414 تک تھا۔ kPa (تصویر، 2 اور مکمل ریمپ ڈیٹا) دیکھیں ضمنی شکل 3)۔
ہلنے کے ساتھ His-NT2RepCT (300 mg/mL) اور b NT (300 mg/mL) کی پیمائش کے دوران درجہ حرارت میں تبدیلی۔تیر درجہ حرارت کے رجحان کی نشاندہی کرتے ہیں، اور سٹوریج ماڈیول ڈیٹا کی ہلکی شیڈنگ مینوفیکچرر کی طرف سے بتائی گئی آلے کے لیے کم ٹارک ویلیوز پر ٹیسٹنگ کو ظاہر کرتی ہے، جو بڑھتے ہوئے شور کی وجہ ہے۔c بلند درجہ حرارت (100, 300, اور 500 mg/mL) کے بعد His-NT2RepCT اور NT کا اختتامی ماڈیول جمع۔تمام ماڈیول ریڈنگز 0.1 ہرٹز کی فریکوئنسی پر لی جاتی ہیں۔
جیلیشن سے وابستہ تبدیلیوں کی تحقیقات کے ممکنہ طریقہ کے طور پر، ہم نے 37 ° C (شکل 3a، b) پر جیلیشن سے پہلے اور بعد میں His-NT2RepCT اور NT کا FTIR سپیکٹرا ریکارڈ کیا۔جیسا کہ توقع کی گئی تھی، His-NT2RepCT اور NT سلوشنز کا سپیکٹرا α-helix/random coil کی ثانوی ساخت کو ظاہر کرنے والے پروٹین سے مطابقت رکھتا ہے، جس کا واضح بینڈ 1645 cm-1 پر ہے۔دونوں ہائیڈروجلز کے لیے، جیلیشن کے نتیجے میں درمیانی I بینڈ میں تقریباً 1617 cm-1 اور 1695 cm-1 (تصویر 3a، b) میں دو بازو بنتے ہیں، جو متوازی β-شیٹ ڈھانچے کی تشکیل کی نشاندہی کرتے ہیں۔ان تبدیلیوں کو متعلقہ سیکنڈ ڈیریویٹیو اور فرق جیلیشن سپیکٹرا (ضمنی شکل 4b) میں بھی واضح طور پر دیکھا جا سکتا ہے۔NT β-پرت کے دو بینڈ His-NT2RepCT کے مقابلے میں زیادہ واضح تھے، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ NT ہائیڈروجیل میں β-پرت کے بینڈ کا کل مواد NT2RepCT ہائیڈروجیل سے زیادہ تھا۔
His-NT2RepCT اور b NT (دونوں 500 mg/mL) کا FTIR جذب کرنے کا سپیکٹرا (حل) سے پہلے اور (جیل) 37°C پر انکیوبیشن کے بعد۔c دوبارہ معطل شدہ 50 mg/ml NT2RepCT جیل اور d NT کی TEM تصاویر۔اسکیل بار 200 این ایم۔e His-NT2RepCT اور NT ہائیڈروجلز کے فائبر قطر۔n = 100 ناپے ہوئے فائبرلز، p <0.0001۔خرابی کی سلاخیں معیاری انحراف کو ظاہر کرتی ہیں۔ایرر بارز کا مرکز وسط ہے۔شماریاتی تجزیہ کے لیے ایک غیر جوڑا ٹی ٹیسٹ (دو دم والا) استعمال کیا گیا تھا۔f مختلف ریکومبیننٹ اسپائیڈروئن پروٹین (100 mg/mL) کی ThT فلوروسینس 37 ° C پر بغیر ہلائے۔g NT (100 mg/mL) ٹیکہ لگانے کے تجربات 100 mg/mL NT جیل سے 0%، 5%، 10%، اور 20% بیج کے ساتھ۔
ٹرانسمیشن الیکٹران مائیکروسکوپی (TEM) کا استعمال کرتے ہوئے جیل کے تجزیے سے معلوم ہوا کہ ہائیڈروجیل امائلائیڈ نما فائبر پر مشتمل ہے (تصویر 3c، 3d)۔NT کی تشکیل شدہ فائبریل لمبی (5–12 nm قطر میں) اور بغیر شاخوں کے تھے، جبکہ His-NT2RepCT فائبرز لمبائی میں چھوٹے اور قطر میں نمایاں طور پر وسیع تھے (7–16 nm) (تصویر 3e)۔ان نتائج نے ہمیں thioflavin T (ThT) پرکھ کا استعمال کرتے ہوئے فبروسس کے حرکیات کی پیروی کرنے کی اجازت دی۔تمام ریکومبیننٹ اسپائیڈروئن پروٹینز کے لیے، فلوروسینٹ سگنل میں اضافہ ہوا جب نمونے 37 °C پر لگائے گئے (تصویر 3f، ضمنی شکل 5a)۔اس کھوج سے ہم آہنگ، NT اور His-NT2RepCT کے خوردبینی معائنے سے جیل کے حالات میں ThT فلوروسینس میں یکساں اضافے کا انکشاف ہوا ہے بغیر ThT-مثبت ایگریگیٹس (ضمنی شکل 5b،c) کے نمایاں مقامی جمع کے۔ThT-Positive fibrils کی تشکیل NT اور His-NTCT ٹربائڈیٹی میں اضافے کے ساتھ نہیں تھی (ضمنی شکل 5d)، جس کا مطلب ہے کہ جیل میں فائبرلز کا نیٹ ورک جیل کی وضاحت پر سمجھوتہ کیے بغیر بن سکتا ہے۔تھوڑی مقدار میں پہلے سے تشکیل شدہ فائبرلز کو شامل کرکے بیج بونے سے کچھ امائلائیڈز 42,43,44 کی فبریل کی تشکیل کو نمایاں طور پر تیز کیا جاسکتا ہے لیکن NT ہائیڈرو کوگولینٹ کے محلول میں 5%، 10% یا 20% (w/w) NT شامل کرنا۔بیج کا اثر (تصویر 3 جی)۔شاید یہ اس حقیقت کی وجہ سے ہے کہ ہائیڈروجیل میں فائبرل نسبتاً طے شدہ ہیں اور انہیں بیج کے طور پر استعمال نہیں کیا جا سکتا۔
اعلی درجہ حرارت پر ریکومبیننٹ اسپائیڈروئن پروٹین کے غیر متوقع رویے نے جیل کی تشکیل سے منسلک تبدیلیوں کی نشاندہی کرنے کے لیے مزید نیوکلیئر مقناطیسی گونج (NMR) اسپیکٹروسکوپی مطالعات کا آغاز کیا۔37°C پر وقت کے ساتھ ریکارڈ کیے گئے His-NT2RepCT سلوشنز کے NMR سپیکٹرا سے پتہ چلتا ہے کہ CT ابھی بھی جزوی طور پر فولڈ تھا، جب کہ NT اور 2Rep سگنلز غائب ہو چکے تھے (تصویر 4a)، یہ بتاتا ہے کہ یہ بنیادی طور پر NT اور 2Rep ہی تھے جو جزوی طور پر ہز-کی تشکیل کو کنٹرول کرتے تھے۔ NT2RepCT ہائیڈروجیل۔CT سگنل کو بھی اس کی اصل شدت کے 20% تک کم کیا گیا تھا، جس سے یہ تجویز کیا گیا تھا کہ CT بھی زیادہ تر طے شدہ ہے اور ہائیڈروجیل ڈھانچے میں شامل ہے۔CT کے ایک چھوٹے حصے کے لیے، جو پہلے سے تیار شدہ نمونے کی طرح موبائل ہے اور اس طرح حل NMR کے ذریعے مشاہدہ کیا گیا ہے، اسپیکٹرا میں پہلے 10 ساختی باقیات کے لیے سگنل کی کمی ہے، ممکنہ طور پر His-NT2Rep کے منسلک حصے کے مشکل متحرک ہونے کی وجہ سے۔ہائیڈروجلز کی -اسٹیٹ -NT2RepCT کے NMR سپیکٹرا نے α-helices اور β-پرتوں کی غالب موجودگی کا انکشاف کیا اور، ایک حد تک، بے ترتیب کوائل کی تشکیل (تصویر 4b)۔صرف NT میں موجود میتھیونین کی باقیات کی کیمیائی تبدیلی کے تجزیے سے پتہ چلتا ہے کہ اس ڈومین کو β-شیٹ ڈھانچے میں تبدیل کر دیا گیا تھا۔حل میں NT کے وقت پر منحصر سپیکٹرا نے سگنل کی شدت (تصویر 4c) میں یکساں کمی ظاہر کی، اور NT ہائیڈروجلز کی ٹھوس حالت NMR نے ظاہر کیا کہ NT کی زیادہ تر باقیات کو β-شیٹ ڈھانچے (تصویر 4d) میں تبدیل کر دیا گیا تھا۔مجموعی طور پر اس کے رجحان کی وجہ سے 2Rep کی تشکیل کا الگ سے تعین نہیں کیا جا سکتا۔تاہم، NTCT اور His-NT2RepCT ہائیڈروجلز کا ٹھوس حالت NMR سپیکٹرا بہت ملتے جلتے نظر آتے ہیں (تصویر 4b؛ ضمنی تصویر 6b)، یہ تجویز کرتا ہے کہ 2Rep نے His-NT2RepCT ہائیڈروجیل کے ساختی حصے میں بہت کم حصہ ڈالا۔CT ہائیڈروجلز کے لیے، α-helices، β-sheets، اور بے ترتیب ہیلیکل سیکنڈری ڈھانچے موجود پائے گئے (ضمیمہ تصویر 6d)۔اس سے پتہ چلتا ہے کہ CT کے کچھ حصے α-helices رہتے ہیں جبکہ دیگر β-sheets بن جاتے ہیں۔اس طرح، NMR سپیکٹروسکوپی کے نتائج بتاتے ہیں کہ NT ہائیڈروجیل کی تشکیل کے لیے اہم ہے اور 2Rep اور CT کے ساتھ فیوژن پر β-شیٹ کی شکل میں بھی تبدیل ہو جاتا ہے۔اس کے ساتھ مطابقت رکھتے ہوئے، ہم نے حال ہی میں پایا کہ امائلائیڈ اسپیشل زپر ممکنہ طور پر NT ڈومین کے تمام پانچ ہیلائسز میں بنتے ہیں، اور والٹز الگورتھم نے ہیلکس 1 (تصویر 4e) میں ایک امائلائیڈوجینک خطے کی پیش گوئی کی ہے۔
15N-HSQC کا 2D سپیکٹرا 10 mg/mL His-NT2RepCT محلول (نیلے) سے پہلے اور انکیوبیشن (سرخ) کے 19 گھنٹے بعد 37°C پر۔سرخ سپیکٹرم میں انفرادی کراس چوٹیوں اور نیلے رنگ کے سپیکٹرم میں F24, G136, polyA کو واحد حرف امینو ایسڈ کی علامتوں اور باقیات کے نمبروں سے ظاہر کیا جاتا ہے۔انسیٹ NT، 2Rep، اور CT ڈومینز سے منتخب اوشیشوں کے لیے وقت پر سگنل کی شدت کا انحصار ظاہر کرتے ہیں۔b سالڈ اسٹیٹ ریڈیو فریکونسی (RFDR) His-NT2RepCT ہائیڈروجلز کا سپیکٹرا۔RFDR سپیکٹرا میں مشاہدہ کردہ Cα/Cβ اوشیشوں کے ارتباط کا تعین ماڈل پیپٹائڈ کیمیکل شفٹوں اور اعدادوشمار 82,83 اور ان کے ثانوی ڈھانچے سے اخذ کردہ اقدار کے مقابلے میں کیا گیا تھا۔SSB - گھومنے والا سائیڈ بینڈ۔c 15N-HSQC 10 mg/mL NT محلول کا ایک جہتی سپیکٹرا 37 ° C پر 36 گھنٹے تک انکیوبیشن کے دوران۔انسیٹ حجم بمقابلہ وقت کی شدت کو ظاہر کرتا ہے۔d NT ہائیڈروجلز کا سالڈ سٹیٹ RFDR سپیکٹرا۔RFDR سپیکٹرا میں مشاہدہ کردہ Cα/Cβ باقیات اور ان کے ثانوی ڈھانچے کے ارتباط کی نشاندہی کی گئی ہے۔e Zipper ڈیٹا بیس (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) سے NT45.79 فیبریلیشن پروپینسٹی پروفائل کی بنیاد پر۔ہیکساپپٹائڈ کی مقامی بجلی کی شفٹ ونڈو کی روزیٹا توانائی kcal/mol میں دکھائی گئی ہے۔سرخ سلاخیں ہائی فبروسس کے رجحان کے ساتھ ہیکساپپٹائڈس کو ظاہر کرتی ہیں (روزیٹا توانائی -23 kcal/mol سے نیچے؛ نقطے والی لکیر کے نیچے)۔سبز سلاخیں دہلیز کے اوپر روزیٹا کی توانائیوں کے ساتھ ٹکڑوں کی نشاندہی کرتی ہیں اور اس وجہ سے اسٹیرک زپر بننے کا امکان کم ہے۔پرولین پر مشتمل ٹکڑوں کو تجزیہ سے خارج کردیا گیا تھا (کالموں کے بغیر)۔مربع والٹز الگورتھم 81 (https://waltz.switchlab.org) کے ذریعہ پیش گوئی کی گئی امائلائیڈوسس کے علاقوں کی نشاندہی کرتی ہے۔NT کے امینو ایسڈ کی باقیات کی ترتیب سب سے اوپر ہے، اور β ثانوی ڈھانچے میں پائی جانے والی باقیات کی اقسام (سالڈ اسٹیٹ NMR سپیکٹروسکوپی کے ذریعے متعین) سرخ رنگ میں دکھائی گئی ہیں۔پانچ NT α-helices کی پوزیشنوں کو (H1-H5)28 کے طور پر نامزد کیا گیا ہے۔
pH <6.5 پر، HT کم ہو جاتا ہے، جو کہ گرمی یا یوریا سے پیدا ہونے والی ڈینیچریشن کے خلاف مزاحم ہوتا ہے۔یہ واضح کرنے کے لیے کہ کس طرح NT dimerization اور استحکام جیلیشن کو متاثر کرتے ہیں، 100 mg/ml NT پر مشتمل محلولوں کو پی ایچ 8، 7، اور 6 پر شیشی الٹا ٹیسٹ کے ذریعے کنٹرول کیا گیا تھا۔NT کے نمونے pH 8 اور 7 جیل میں 30 منٹ کے بعد 37 ° C پر لگائے گئے، لیکن pH 8 جیل واضح رہے، جب کہ pH 7 جیل نے ایک نظر آنے والی تیز رفتار ظاہر کی (تصویر 5a)۔اس کے برعکس، pH 6 پر HT پر مشتمل محلول نے جیل نہیں بنایا، اور 37 ° C پر 20 منٹ کے بعد ایک بڑا جھلک دیکھا جا سکتا ہے۔اس سے پتہ چلتا ہے کہ monomers کے مقابلے میں dimers خود اور/یا ان کی زیادہ استحکام جیلیشن کو روکتا ہے۔پی ایچ 7 اور 6 پر NT کے لیے ایک ورن کی تشکیل متوقع نہیں تھی، کیونکہ یہ بتایا گیا ہے کہ NT 200 mg/ml27 پر گھلنشیل ہے، گرمی کی کمی کے بعد آسانی سے دوبارہ بن جاتا ہے، اور α-helix کو بھی نچلی قدروں پر برقرار رکھتا ہے۔ pH 18. ان تضادات کی ایک ممکنہ وضاحت یہ ہے کہ پہلے بتائے گئے تجربات کمرے کے درجہ حرارت یا اس سے کم، یا نسبتاً کم پروٹین کی تعداد 16,18,19 پر کیے گئے تھے۔
NT شیشی الٹا ٹیسٹ (100 mg/mL) pH 8, 7, 6 اور 154 mM NaCl (pH 8) پر 37 ° C پر انکیوبیشن کے بعد۔b NT CD سپیکٹرا بالترتیب 154 mM NaF اور 154 mM NaCl کے ساتھ اور بغیر۔222 nm پر داڑھ بیضوی کو قدرتی تہوں کے تناسب میں تبدیل کیا جاتا ہے۔c NT الٹا پرکھ (100 mg/mL) NT* (37 °C اور 60 °C)، NTA72R (37 °C)، اور His-NT-L6 (37 °C اور 60 °C)۔d NT mutants NT*, NTA72R، اور His-NT-L6 کا CD سپیکٹرا۔222 nm پر داڑھ بیضوی کو قدرتی تہوں کے تناسب میں تبدیل کیا جاتا ہے۔e NTFlSp، NTMiSp اور کم شدہ NTMiSp (100 mg/mL) کا الٹا ٹیسٹ۔اسکیل بار 5 ملی میٹر۔f NT کا CD سپیکٹرا، NTFlSp، NTMiSp اور کم کیا ہوا NTMiSp۔222 nm پر داڑھ بیضوی کو قدرتی تہوں کے تناسب میں تبدیل کیا جاتا ہے۔25 ° C اور 95 ° C پر مکمل NT سپیکٹرا کو ضمنی شکل 8 میں دکھایا گیا ہے۔
جسمانی نمک کا ارتکاز NT ذیلی یونٹس کے درمیان الیکٹرو اسٹاٹک تعاملات اور NT کی منتقلی کے نچلے pH18 میں dimerization کا تعین کرتا ہے۔ہم نے پایا کہ 154 ایم ایم NaCl اور NaF کی موجودگی نے بالترتیب جیلیشن کو روکا (تصویر 5a، b؛ ضمنی شکل 2b) اور یہ کہ ان نمکیات نے NT monomers کے تھرمل استحکام کو بڑھایا (تصویر 5b، ضمنی شکل 8) .یہ بھی تجویز کرتا ہے کہ استحکام میں اضافہ، dimerization کے بجائے، جیل کی تشکیل کو روکتا ہے۔
جیلیشن میں پروٹین ڈائمرائزیشن اور استحکام کے کردار کو مزید دریافت کرنے کے لیے، ہم نے دو اتپریورتیوں، NT* اور NTA72R کا استعمال کیا، جو کم pH28.30 پر بھی monomeric رہتے ہیں۔NT* ایک ڈبل چارج ریورسل اتپریورتی ہے جس میں مونومر کی بظاہر ڈوپولر چارج ڈسٹری بیوشن کو چپٹا کر دیا جاتا ہے، جو dimerization کو روکتا ہے اور monomer کے استحکام میں زبردست اضافہ کرتا ہے۔NTA72R ایک چارج شدہ ڈوپول ہے، لیکن Arg-substituted Ala dimer کی حد پر واقع ہے، لہذا تغیرات dimerization کے لیے ضروری subunit تعاملات میں مداخلت کرتے ہیں۔37°C پر انکیوبیشن پر، NT* نے ہائیڈروجیل نہیں بنایا، جبکہ NTA72R نے 15 منٹ (تصویر 5c) کے لیے ایک مبہم جیل بنایا۔چونکہ NT* اور NTA72R دونوں ڈائمرائز نہیں کر سکتے لیکن مونومر استحکام (تصویر 5d) میں مختلف ہیں، یہ نتائج سختی سے تجویز کرتے ہیں کہ اعلی تھرموڈینامک استحکام NT کو جیلنگ سے روکتا ہے۔اس کی تائید اس حقیقت سے بھی ہوتی ہے کہ HT* ایک جیل بناتا ہے جب یہ اعلی درجہ حرارت پر غیر مستحکم ہوتا ہے (8 منٹ کے بعد 60°C پر؛ تصویر 5c)۔یہ پہلے دکھایا گیا ہے کہ NT میں میتھیونین کا اعلیٰ مواد اس کی قدرتی تہہ کو مائع کرتا ہے اور یہ کہ چھ میٹ ٹو لیو متبادل (جسے یہاں His-NT-L6 کہا جاتا ہے) NT46 مونومر کو مضبوطی سے مستحکم کرتے ہیں۔اس مفروضے کی بنیاد پر کہ NT جیل کی تشکیل کے لیے ساختی لچک کی ضرورت ہے، ہم نے پایا کہ His-NT-L6 مستحکم اتپریورتی 37 ° C (شکل 5c، d) پر جیل نہیں بنا۔تاہم، His-NT-L6 نے 60 °С پر 60 منٹ (تصویر 5c) کے لیے انکیوبیشن پر ایک جیل بھی بنایا۔
NT کی β-شیٹ ڈھانچے میں تبدیل ہونے اور ہائیڈروجلز بنانے کی صلاحیت کچھ پر لاگو ہوتی ہے لیکن اسپائیڈروئن کے تمام NT ڈومینز پر نہیں۔ریشم کی مختلف اقسام اور مکڑی کی انواع کے NTs، Trichonephila clavipes (NTFlSp) نے اپنے نسبتاً کم میتھیونین مواد اور اعلی تھرمل استحکام کے باوجود جیل بنائے (تصویر 5e، f اور ضمنی جدول 2)۔اس کے برعکس، کم تھرمل استحکام اور اعلی میتھیونین مواد کے ساتھ Araneus ventricosus (NTMiSp) سے چھوٹے امپولر پروٹین اسپائیڈروئن سے NT نے ہائیڈروجلز نہیں بنائے (ضمنی جدول 2 اور تصویر 5e، f)۔مؤخر الذکر انٹرمولیکولر ڈسلفائڈ بانڈز 29,47 کی موجودگی سے وابستہ ہوسکتا ہے۔مستقل طور پر، جب NTMiSp کے ڈسلفائیڈ بانڈز کو کم کیا گیا، تو اس نے 10 منٹ (تصویر 5e) کے لیے 37 ° C پر انکیوبیشن کے بعد ایک ہائیڈروجیل بنایا۔آخر میں، یہ غور کرنا چاہیے کہ ساختی لچک ایک اہم ہے، لیکن NT سے جیل کی تشکیل کے لیے واحد معیار نہیں۔ایک اور عنصر جو متعلقہ ہو سکتا ہے وہ ہے امائلائیڈ فائبرز بنانے کا رجحان، اور زپر ڈیٹا بیس اور والٹز الگورتھم کے ساتھ تجزیہ نے جیل بنانے کی صلاحیت اور امائلائیڈوجینک خطوں کی موجودگی کے ساتھ ساتھ پیش گوئی کی گئی خطوں کی حد کے درمیان ارتباط ظاہر کیا۔ سٹیرک زپ بنانے کے لیے۔ایک ارتباط تھا (ضمنی جدول 2 اور ضمنی شکل 9)۔
NT کی فائبرلز بنانے اور سازگار حالات میں جیل بنانے کی صلاحیت نے ہمیں یہ قیاس کرنے پر مجبور کیا کہ دیگر پروٹین کے ٹکڑوں کے ساتھ NT فیوژن اب بھی فیوژن پارٹنرز کے مکمل کام کے ساتھ جیل بنا سکتے ہیں۔اس کی جانچ کرنے کے لیے، ہم نے بالترتیب NT کے سی ٹرمینس میں گرین فلوروسینٹ پروٹین (GFP) اور purine nucleoside phosphorylase (PNP) متعارف کرایا۔نتیجے میں فیوژن پروٹین کا اظہار E. coli میں بہت زیادہ حتمی پیداوار کے ساتھ کیا گیا (150 mg/L اور 256 mg/L شیک فلاسک کلچر برائے His-NT-GFP اور His-NT-PNP، بالترتیب)، جو دکھایا گیا ہے اس کے مطابق۔ NT Ref میں ملانے والے دوسرے پروٹین کے لیے۔30. His-NT-GFP (300mg/mL) اور His-NT-PNP (100mg/mL) فیوژن پروٹین 2 گھنٹے اور 6.5 گھنٹے کے بعد 37 ° C پر جیل بنتے ہیں اور اہم بات یہ ہے کہ GFP فریکشن میں کوئی تبدیلی نہیں ہوئی۔جیلیشن کے بعد مشاہدہ کیا گیا، جیلیشن کے بعد 70% ابتدائی فلوروسینس کی شدت باقی رہ گئی (تصویر 6a)۔اس کے-NT-PNP حلوں اور جیلوں میں PNP کی سرگرمی کی پیمائش کرنے کے لئے، ہمیں فیوژن پروٹین کو NT کے ساتھ پتلا کرنا پڑا کیونکہ خالص تیاری کی انزیمیٹک سرگرمی جیلنگ ارتکاز میں پرکھ کی کھوج کی حد سے باہر تھی۔0.01 mg/mL His-NT-PNP اور 100 mg/mL NT پر مشتمل مرکب کے ساتھ بننے والی جیل نے پہلے سے تیار شدہ نمونوں کی ابتدائی انزیمیٹک سرگرمی کا 65% برقرار رکھا (تصویر 6b)۔پیمائش کے دوران جیل برقرار رہا (ضمیمہ تصویر 10)۔
His-NT-GFP (300 mg/mL) اور الٹی شیشی جس میں His-NT-GFP ہائیڈروجیل (300 mg/mL) نظر آتی ہے اور UV روشنی کے تحت جلائی جاتی ہے اس سے پہلے اور بعد میں متعلقہ فلوروسینس کی شدت۔پوائنٹس انفرادی پیمائش (n = 3) دکھاتے ہیں، غلطی کی سلاخیں معیاری انحراف ظاہر کرتی ہیں۔اوسط قدر ایرر بارز کے بیچ میں دکھائی جاتی ہے۔b PNP سرگرمی NT (100 mg/ml) اور 0.01 mg/ml his-NT-PNP اور 100 mg/ml نیو تائیوان ڈالر پر مشتمل حل اور جیلوں کا استعمال کرتے ہوئے فلورومیٹرک تجزیہ کے ذریعے حاصل کی گئی۔انسیٹ ایک الٹی شیشی دکھاتا ہے جس میں ہائیڈروجیل ہوتا ہے جس میں His-NT-PNP (5 ملی میٹر اسکیل بار) ہوتا ہے۔
یہاں، ہم 37 ° C (شکل 1) پر پروٹین کے محلول کو انکیوبیٹ کرکے NT اور دیگر ریکومبیننٹ اسپائیڈروئن پروٹین سے ہائیڈروجلز کی تشکیل کی اطلاع دیتے ہیں۔ہم یہ ظاہر کرتے ہیں کہ جیلیشن α-helices کی β-پرتوں میں تبدیلی اور amyloid-like fibrils (Figs. 3 اور 4) کی تشکیل سے وابستہ ہے۔یہ دریافت حیران کن ہے کیونکہ NTs کوائلڈ گلوبلولر فائیو ہیلکس بنڈل ہیں جو ان کی انتہائی اعلی حل پذیری اور اعلی استحکام کے لیے جانا جاتا ہے> 200 mg/mL 4°C پر کئی دنوں تک۔اس کے علاوہ، NTs آسانی سے µM میں کم پروٹین کی تعداد میں گرمی کی کمی کے بعد دوبارہ فولڈ ہوجاتے ہیں۔ہمارے نتائج کے مطابق، فائبرل کی تشکیل کے لیے 10 ملی گرام/ملی لیٹر پروٹین کے ارتکاز اور قدرے بلند درجہ حرارت (تصویر 1) کے امتزاج کی ضرورت ہوتی ہے۔یہ اس خیال سے مطابقت رکھتا ہے کہ امائلائیڈ فائبرز عالمی سطح پر فولڈ پروٹینز سے بن سکتے ہیں جو جسمانی حالات 48 کے تحت تھرمل اتار چڑھاؤ کی وجہ سے جزوی طور پر کھلی ہوئی حالت میں ہوتے ہیں۔اس تبدیلی سے گزرنے والے پروٹین کی مثالوں میں انسولین 49,50، β2-مائکروگلوبلین، ٹرانستھائیریٹین اور لائسوزیم 51,52,53 شامل ہیں۔اگرچہ NT اپنی آبائی حالت میں ایک α-ہیلکس ہے، پولی پیپٹائڈ چین کا تقریباً 65% سٹیرک زپر کی تشکیل (تصویر 4e) 45 کے ساتھ مطابقت رکھتا ہے۔چونکہ مونومر متحرک طور پر موبائل 46 ہے، اس لیے یہ ان ممکنہ امائلائیڈوجینک خطوں کو اعتدال سے بلند درجہ حرارت پر بے نقاب کر سکتا ہے اور کل پروٹین کے زیادہ ارتکاز پر امائلائیڈ فائبرل کی تشکیل کے لیے ایک اہم ارتکاز تک پہنچ سکتا ہے۔اس استدلال کے بعد، ہم نے اسپائیڈروئن کے ارتکاز اور جیلیشن ٹائم (تصویر 1c) کے درمیان ایک منفی تعلق پایا، اور اگر monomeric NT کی تشکیل یا تو اتپریورتنوں (NT*, His-NT-L6) کے ذریعے یا نمک کے اضافے سے مستحکم ہوتی ہے، تو یہ روک سکتا ہے۔ تشکیل ہائیڈروجلز (تصویر 5)۔
زیادہ تر صورتوں میں، امائلائیڈ فائبرز حل سے ایک پریزیٹیٹ کے طور پر غائب ہو جاتے ہیں، لیکن بعض حالات میں وہ ہائیڈروجلز 55,56,57 بنا سکتے ہیں۔ہائیڈروجیل بنانے والے فائبرلز میں عام طور پر ایک اعلی تناسب ہوتا ہے اور سالماتی الجھن کے ذریعے مستحکم سہ جہتی نیٹ ورک تشکیل دیتے ہیں، 55,58 ہمارے نتائج کے مطابق۔وٹرو میں ہائیڈروجیل کی تشکیل کے لیے، پروٹین اکثر مکمل یا جزوی طور پر ظاہر ہوتے ہیں، مثال کے طور پر، نامیاتی سالوینٹس، اعلی درجہ حرارت (70–90°C) اور/یا کم پی ایچ (1.5–3.0)59,60,61,62 کی نمائش سے۔یہاں بیان کردہ اسپائیڈروئن ہائیڈروجلز کو سخت پروسیسنگ کی ضرورت نہیں ہے، اور نہ ہی انہیں ہائیڈروجلز کو مستحکم کرنے کے لیے کراس لنکنگ ایجنٹوں کی ضرورت ہے۔
اس سے پہلے یہ اطلاع دی گئی ہے کہ اسپائیڈروئن دہراتا ہے اور QDs، جو ریشم کی کتائی کے دوران β-شیٹ سوئچنگ سے گزرتے دکھائی دیتے ہیں، ہائیڈروجلز بناتے ہیں۔ہمارے نتائج کے مقابلے میں، انکیوبیشن کے اوقات اور/یا انکیوبیشن کا درجہ حرارت بالترتیب نمایاں طور پر لمبا یا زیادہ تھا، اور نتیجے میں آنے والے ہائیڈروجلز اکثر مبہم ہوتے تھے (شکل 7 اور ضمنی جدول 1) 37، 38، 63، 64، 65، 66، 67، 68 , 69. تیز جیل کے اوقات کے علاوہ، NT ہائیڈروجلز>300 mg/mL (30%) نے دیگر تمام بیان کردہ ریکومبیننٹ اسپائیڈر سلک پروٹین ہائیڈروجلز کے ساتھ ساتھ قدرتی ہائیڈروجلز جیسے جیلیٹن، الگنیٹ (2%)، آگر (0.5%) کو پیچھے چھوڑ دیا۔ ) اور کولیجن۔(0.6%) (شکل 7 اور ضمنی جدولیں 1 اور 3) 37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74۔
اس مطالعے میں ہائیڈروجلز کے جیل ٹائم اور لچکدار ماڈیولس کا موازنہ دیگر اسپائیڈروئن پر مبنی ہائیڈروجلز اور منتخب قدرتی ہائیڈروجلز کے ساتھ کیا گیا۔حوالہ جات جیلیشن کے حالات کی وضاحت کے ساتھ دیئے گئے ہیں۔اے پی ایس امونیم پرسلفیٹ، کمرے کا درجہ حرارت۔ڈیٹا 37، 38، 39، 64، 65، 66، 67، 68، 69، 70، 71، 72، 73، 74۔
ایسا لگتا ہے کہ مکڑیوں نے اسٹوریج کے دوران اسپائیڈروئن کو جیلنگ سے روکنے کے طریقے تیار کیے ہیں۔ریشم کے غدود میں پروٹین کے زیادہ ارتکاز کے باوجود، ٹرمینل ڈومین سے وابستہ بڑے ریپیٹ ریجن کا مطلب یہ ہے کہ غدود میں NT اور CT کا ظاہری ارتکاز تقریباً 10-20 mg/ml کے مساوی ہے، اس تحقیق کی حد میں۔وٹرو مشاہدہ شدہ ہائیڈروجیل کی تشکیل کے لیے ضروری ہے۔اس کے علاوہ، نمکیات کی اسی طرح کی ارتکاز 16 مستحکم NT، جیسا کہ ریشم کے غدود میں ہوتا ہے (تصویر 5b)۔NT کی تشکیل کا مطالعہ E. coli cytosol میں کیا گیا ہے اور اسے وٹرو میں جانچنے کے مقابلے میں زیادہ مضبوطی سے فولڈ پایا گیا ہے، مزید یہ ظاہر کرتا ہے کہ نمک یا دیگر عوامل Vivo میں اس کے جمع ہونے کو روکتے ہیں۔تاہم، NTs کی β-sheet fibrils میں تبدیل ہونے کی صلاحیت فلیمینٹ کی تشکیل کے لیے اہم ہو سکتی ہے اور مستقبل کے مطالعے میں اس کی چھان بین کی جانی چاہیے۔
اس مطالعہ میں مشاہدہ کردہ NT-amyloid-like fibril اور hydrogel کی تشکیل کے نئے پہلوؤں کے علاوہ، ہم یہ بھی ظاہر کرتے ہیں کہ اس رجحان میں بائیو ٹیکنالوجی اور بائیو میڈیکل ایپلی کیشنز ہو سکتے ہیں (تصویر 8)۔تصور کے ثبوت کے طور پر، ہم نے NT کو GFP یا PNP کے ساتھ جوڑ کر دکھایا کہ فیوژن پروٹین بھی ہائیڈروجلز بناتا ہے جب 37 ° C پر انکیوبیٹ کیا جاتا ہے اور GFP اور PNP فریکشن بڑی حد تک جیلیشن کے بعد اپنی سرگرمی کو برقرار رکھتے ہیں (شکل 6)۔نیوکلیوسائیڈ فاسفوریلیسز نیوکلیوسائیڈ اینالاگس75 کے اہم اتپریرک ترکیب ہیں، جو ہماری دریافت کو بائیو فارماسیوٹیکل انڈسٹری کے لیے متعلقہ بناتا ہے۔فیوژن پروٹینوں کے اظہار کا تصور جو کہ سازگار حالات میں شفاف ہائیڈروجلز کی تشکیل کرتے ہیں، انزائم اموبیلائزیشن، کنٹرولڈ ڈرگ ریلیز اور ٹشو انجینئرنگ جیسے وسیع رینج کے لیے سازگار خصوصیات کے ساتھ فعال ہائیڈروجلز کی تخلیق کی اجازت دیتا ہے۔اس کے علاوہ، NT اور NT* موثر ایکسپریشن مارکر 30 ہیں، جس کا مطلب ہے کہ NT اور اس کی مختلف حالتوں کو حل پذیر فیوژن پروٹین کی اعلیٰ تھرو پٹ پیداوار اور 3D ہائیڈروجلز میں متحرک ہدف پروٹین کی تخلیق کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔
NT حل پذیر، α-ہیلیکل اور کم ارتکاز (µM) اور 37°C پر مستحکم ہے۔ایک ہی درجہ حرارت پر، لیکن بڑھتی ہوئی ارتکاز (>10 ملی گرام/ملی لیٹر) پر، NT جیلیں بناتا ہے جس میں امائلائیڈ نما فائبرز ہوتے ہیں۔NT فیوژن پروٹین مکمل طور پر فعال فیوژن ٹکڑوں کے ساتھ فائبرلر جیل بھی بناتے ہیں، جس سے NT کا استعمال کرتے ہوئے مختلف پروٹینوں کو 3D ہائیڈروجلز میں متحرک کیا جا سکتا ہے۔نیچے: NT (PDB: 4FBS) اور فائبر نیٹ ورکس اور متعلقہ پروٹین ڈھانچے کی عکاسی (مفروضہ اور پیمانے پر نہیں بنایا گیا، GFP PDB: 2B3Q، 10.2210/pdb2B3Q/pdb؛ PNP PDB: 4RJ2, 10.22210/pdbRJ)۔
تعمیرات (امینو ایسڈ کی ترتیب سمیت مکمل فہرست کے لیے ضمنی جدول 4 دیکھیں) کو پلاسمڈ pT7 میں کلون کیا گیا اور E. coli BL21 (DE3) میں تبدیل کیا گیا۔انجنیئرڈ پلاسمیڈز پر مشتمل E. کولی کو لوریا شوربے میں کنامیسن (70 mg/l) کے ساتھ ٹیکہ لگایا گیا اور 30°C اور 250 rpm پر راتوں رات اگایا گیا۔اس کے بعد کلچر کو 1/100 LB میڈیم میں ٹیکہ لگایا گیا جس میں کنامیسن شامل تھا اور 30°C اور 110 rpm پر کلچر کیا گیا جب تک کہ OD600 0.8 تک نہ پہنچ جائے۔NMR مطالعہ کے لیے، بیکٹیریا کو M9 کم سے کم درمیانے درجے میں اگایا گیا جس میں آاسوٹوپس کے ساتھ پروٹین لیبلنگ کے لیے 2 جی ڈی گلوکوز 13 سی (الڈرچ) اور 1 جی امونیم کلورائیڈ 15 این (کیمبرج آئسوٹوپ لیبارٹریز، انکارپوریشن) شامل ہیں۔درجہ حرارت کو 20 ڈگری سینٹی گریڈ تک کم کریں اور 0.15 ایم ایم آئسوپروپلتھیوگالیکٹوپیرانوسائیڈ (حتمی ارتکاز) کے ساتھ پروٹین کے اظہار کی حوصلہ افزائی کریں۔رات بھر پروٹین کے اظہار کے بعد، خلیات کو 20 منٹ کے لیے 7278×g، 4° C پر کاٹا گیا۔سیل چھرروں کو 20 ایم ایم Tris-HCl، pH 8 میں دوبارہ معطل کر دیا گیا اور مزید استعمال تک منجمد کر دیا گیا۔پگھلے ہوئے خلیوں کو 30 kPa پر سیل ڈسپوٹر (TS سیریز مشینیں، کانسٹنٹ سسٹمز لمیٹڈ، انگلینڈ) کا استعمال کرتے ہوئے لیس کیا گیا۔پھر لائسیٹس کو 25,000 گرام پر 30 منٹ کے لیے 4 ° C پر سینٹرفیوج کیا گیا۔NTMiSp کے لیے، گولی کو پھر 2 M یوریا، 20 mM Tris-HCl، pH 8 میں دوبارہ معطل کیا گیا، اور 2 منٹ (2 s آن/آف، 65%) کے لیے سونیکیٹ کیا گیا، پھر 25,000 xg، 4° C. کے اندر دوبارہ سینٹرفیوج کیا گیا۔ 30 منٹسپرنٹنٹ کو ایک Ni-NTA کالم پر لوڈ کیا گیا، اسے 20 mM Tris-HCl، 2 mM imidazole، pH 8 سے دھویا گیا، اور آخر میں پروٹین کو 20 mM Tris-HCl، 200 mM imidazole، pH 8 کے ساتھ صاف کیا گیا۔ NT2RepCT اور پیدا کرنے کے لیے NTCT، thrombin ہضم اس اور NT کے درمیان سائٹ (ThrCleav) کو متعارف کراتا ہے۔تھرومبن کلیویج سائٹس His-NT-ThrCleav-2Rep (2Rep پیدا کرتا ہے)، His-thioredoxin-ThrCleav-NT (NT پیدا کرتا ہے)، His-thioredoxin-ThrCleav-CT (CT پیدا کرتا ہے)، His-Thioredoxin-ThrCleav-NT میں بھی موجود ہیں۔ .* (NT* تیار کرتا ہے)، His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (NTA72R پیدا کرتا ہے)، His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (NTF1Sp پیدا کرتا ہے)، اور His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (NTMiSp تیار کرتا ہے)۔تعمیرات کو تھرومبن (1:1000) کے ساتھ ہضم کیا گیا اور 20 ایم ایم Tris-HCl، pH 8 کے ساتھ راتوں رات 4° C پر ڈائلائز کیا گیا، 6-8 kDa کی مالیکیولر ویٹ تھریشولڈ کے ساتھ سپیکٹرا/پور ڈائلیسس جھلی کا استعمال کرتے ہوئے۔ڈائیلاسز کے بعد، محلول کو ایک Ni-NTA کالم پر لوڈ کیا جاتا ہے اور اس میں دلچسپی کے پروٹین پر مشتمل فضلہ جمع کیا جاتا ہے۔پروٹین کے ارتکاز کا تعین 280 nm پر UV جذب کی پیمائش کرکے ہر پروٹین کے معدوم ہونے کے قابلیت کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا، سوائے NTF1Sp کے، جس نے مینوفیکچرر کے پروٹوکول کے مطابق بریڈ فورڈ پرکھ کا استعمال کیا۔طہارت کا تعین ایس ڈی ایس پولی کریلامائڈ (4–20٪) جیل الیکٹروفورسس اور کوماسی شاندار نیلے داغ کے ذریعے کیا گیا تھا۔20 منٹ کے چکروں میں 10 kDa مالیکیولر ویٹ کٹ آف کے ساتھ 4000 xg پر سینٹری فیوج فلٹرز (VivaSpin 20, GE Healthcare) کا استعمال کرتے ہوئے پروٹین کو مرتکز کیا گیا۔
پروٹین کے محلول کو پگھلائیں اور احتیاط سے 150 μl کو 1 ملی لیٹر صاف سیپٹم شیشی (8 x 40 ملی میٹر تھرمو سائنٹیفک) میں ڈالیں۔بخارات کو روکنے کے لیے ٹیوبوں کو پیرا فلم کے ساتھ بند کر کے سیل کر دیا گیا تھا۔نمونے (n = 3) کو 37 ° C یا 60 ° C پر انکیوبیٹ کیا گیا تھا اور وقتا فوقتا جیلیشن کا مشاہدہ کرنے کے لئے الٹا جاتا تھا۔وہ نمونے جو جیل نہیں کرتے تھے کم از کم ایک ہفتے تک انکیوبیٹ کیے گئے تھے۔10 mM DTT فی 10 µM پروٹین کے ساتھ NTMiSp ڈسلفائیڈ بانڈز کو کم کریں۔قدرتی اسپائیڈر سلک کوٹنگز کے جیلیشن کا تجزیہ کرنے کے لیے، سویڈش برج اسپائیڈر کو کاٹا گیا، دو اہم امپللیٹڈ گلینڈز کو 200 μl 20 mM Tris-HCl بفر pH 8 میں رکھا گیا اور کوٹنگ کو غدود سے الگ کرنے کے لیے کاٹا گیا۔.غدود کے مواد کو بفر میں تحلیل کیا جاتا ہے، خشک وزن کے تعین کے لیے 50 µl (کھلی شیشیوں کو 60 ° C پر مستقل وزن تک انکیوبیشن کے ذریعے) اور 37 ° C پر جیلیشن کے لیے 150 µl۔
پیمائش کرنے والا جیومیٹری/ٹول 20 ملی میٹر کے اوپری قطر اور 0.5 ملی میٹر کے وقفے کے ساتھ متوازی پلیٹ کا استعمال کرتے ہوئے سٹینلیس سٹیل سے بنا ہے۔نمونے کو 25 ° C سے 45 ° C تک اور 1 ° C فی منٹ کی شرح سے سٹینلیس سٹیل کے نیچے پیلٹیئر پلیٹ کا استعمال کرتے ہوئے 25 ° C پر واپس کریں۔کمپن پیمائش 0.1 ہرٹز کی فریکوئنسی پر اور مواد کے لکیری ویسکوئلاسٹک خطے میں بالترتیب 100 ملی گرام / ایم ایل اور 300-500 ملی گرام / ایم ایل کے نمونوں کے لئے 5٪ اور 0.5٪ کے تناؤ پر کی گئی۔بخارات کو روکنے کے لیے حسب ضرورت نمی کے چیمبر کا استعمال کریں۔پرزم 9 کا استعمال کرتے ہوئے ڈیٹا کا تجزیہ کیا گیا۔
اورکت (IR) سپیکٹرا کو کمرے کے درجہ حرارت پر 800 سے 3900 cm–1 تک جمع کرنے کے لیے۔اے ٹی آر ڈیوائس کے ساتھ ساتھ اسپیکٹومیٹر کے ذریعے روشنی کے راستے کو تجربے سے پہلے اور اس کے دوران خشک فلٹر شدہ ہوا سے صاف کیا جاتا ہے۔حل (500 mg/mL سپیکٹرا میں پانی کے جذب کی چوٹیوں کو کم سے کم کرنے کے لیے) کرسٹل پر پائپ کیا گیا، اور جیل (500 mg/mL) پیمائش سے پہلے بنائے گئے اور پھر کرسٹل میں منتقل کیے گئے (n = 3)۔1000 اسکینز 2 سینٹی میٹر-1 کی ریزولوشن اور 2 کے زیرو ڈیوٹی سائیکل کے ساتھ ریکارڈ کیے گئے۔ دوسرے مشتق کو نو پوائنٹس کی ہموار حد کا استعمال کرتے ہوئے OPUS (Bruker) کا استعمال کرتے ہوئے شمار کیا گیا۔F. Menges "Spectragryph - Optical Spectroscopy Software" کا استعمال کرتے ہوئے سپیکٹرا کو 1720 اور 1580 cm-1 کے درمیان اسی انضمام والے علاقے میں معمول بنایا گیا تھا۔ATR-IR سپیکٹروسکوپی میں، ایک نمونے میں انفراریڈ بیم کی دخول کی گہرائی ویوینمبر پر منحصر ہوتی ہے، جس کے نتیجے میں اعلی موج نمبروں کے مقابلے کم موج نمبروں پر مضبوط جذب ہوتا ہے۔انجیر میں دکھائے گئے سپیکٹرا کے لیے ان اثرات کو درست نہیں کیا گیا ہے۔3 کیونکہ وہ بہت چھوٹے ہیں (ضمیمہ تصویر 4)۔اس اعداد و شمار کے لیے درست سپیکٹرا کا حساب Bruker OPUS سافٹ ویئر کے ذریعے کیا گیا۔
اصولی طور پر، امائیڈ I چوٹی کے اندر اجزاء کے قابل اعتماد ڈیکونولوشن کے بعد پروٹین کی شکلوں کی ایک جامع مقدار کا تعین ممکن ہے۔تاہم، عملی طور پر کچھ رکاوٹیں پیدا ہوتی ہیں۔سپیکٹرم میں شور deconvolution کے دوران (جھوٹی) چوٹیوں کے طور پر ظاہر ہو سکتا ہے۔اس کے علاوہ، پانی کے موڑنے کی وجہ سے چوٹی امائڈ I چوٹی کی پوزیشن کے ساتھ ملتی ہے اور پانی کی ایک بڑی مقدار پر مشتمل نمونوں کے لیے اسی طرح کی وسعت ہو سکتی ہے، جیسا کہ یہاں زیر مطالعہ آبی جیل۔لہذا، ہم نے امائڈ I چوٹی کو مکمل طور پر گلنے کی کوشش نہیں کی، اور ہمارے مشاہدات کو صرف دوسرے طریقوں جیسے NMR سپیکٹروسکوپی کی حمایت میں ہی سمجھا جانا چاہیے۔
50 mg/ml NT اور His-NT2RepCT کے حل راتوں رات 37 ° C پر جیل کیے گئے۔اس کے بعد ہائیڈروجیل کو 20 mM Tris-HCl (pH 8) کے ساتھ 12.5 mg/ml کے ارتکاز میں پتلا کیا گیا، اچھی طرح ہلایا گیا اور جیل کو توڑنے کے لیے پائپ کیا گیا۔اس کے بعد، ہائیڈروجیل کو 20 ایم ایم ٹریس-ایچ سی ایل (پی ایچ 8) کے ساتھ 10 بار پتلا کیا گیا، نمونے کا 5 μl فارمور کے ساتھ لیپت تانبے کے گرڈ پر لگایا گیا، اور اضافی نمونے کو بلوٹنگ پیپر سے ہٹا دیا گیا۔نمونوں کو 5 µl ملی کیو پانی سے دو بار دھویا گیا اور 5 منٹ کے لیے 1٪ یورینیل فارمیٹ سے داغ دیا گیا۔جاذب کاغذ سے اضافی داغ ہٹائیں، پھر میش کو ہوا سے خشک کریں۔ان گرڈز پر 100 kV پر کام کرنے والے FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN کا استعمال کرتے ہوئے امیجنگ کی گئی۔ویلٹا 2k × 2k CCD کیمرے (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Germany) کا استعمال کرتے ہوئے تصاویر x 26,500 اور x 43,000 میگنیفیکیشن پر ریکارڈ کی گئیں۔ہر نمونے کے لیے (n = 1)، 10–15 تصاویر ریکارڈ کی گئیں۔امیج جے (https://imagej.nih.gov/) کو تصویری تجزیہ اور فائبر قطر (n = 100، مختلف ریشوں) کی پیمائش کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔پرزم 9 کا استعمال بغیر جوڑ والے ٹی ٹیسٹ (دو دم والا) کرنے کے لیے کیا گیا تھا۔اوسط His-NT2RepCT اور NT fibrils بالترتیب 11.43 (SD 2.035) اور 7.67 (SD 1.389) nm تھے۔اعتماد کا وقفہ (95%) -4.246 سے -3.275 ہے۔آزادی کی ڈگری = 198، p <0.0001۔
80 µl مائع نمونے جن میں 10 µM thioflavin T (ThT) شامل ہیں کو کارننگ 96-well بلیک باٹم کلیئر بوٹم پلیٹس (کارننگ گلاس 3881، USA) کا استعمال کرتے ہوئے جامد حالات میں سہ رخی (n = 3) میں ماپا گیا۔فلوروسینس فرق 440 nm ایکسائٹیشن فلٹر اور 480 nm اخراج فلٹر (BMG Labtech، Offenburg، Germany سے FLUOStar Galaxy) کا استعمال کرتے ہوئے ریکارڈ کیا گیا۔ThT سگنل نہ تو سیر ہوا تھا اور نہ ہی بجھایا گیا تھا، کیونکہ سگنل کی شدت کو تبدیل کیے بغیر ThT کے مختلف ارتکاز کے ساتھ تجربات کیے گئے تھے۔کہرے کی پیمائش کے لیے 360 nm پر جذب کو ریکارڈ کریں۔بوائی کے تجربات کے لیے، 100 mg/mL جیل 37 ° C. پر بنائے گئے، دوبارہ معطل کیے گئے، اور 5%، 10%، اور 20% کے داڑھ کے تناسب پر بوائی کے لیے استعمال کیے گئے۔پرزم 9 کا استعمال کرتے ہوئے ڈیٹا کا تجزیہ کیا گیا۔
His-NT2RepCT اور NT>100 mg/mL کے اسٹاک کو برف پر پگھلائیں اور 0.22 µm فلٹر کے ذریعے فلٹر کریں۔Nanodrop کا استعمال کرتے ہوئے 280 nm پر جذب کی پیمائش کرکے حراستی کا حساب لگایا گیا۔96 کنویں کی بلیک نان بائنڈنگ پلیٹ (کارننگ) کے کنوؤں میں ایک واضح نیچے کے ساتھ، نمونوں کو 20 mM Tris-HCl pH 8 میں 20 mg/ml تک پتلا کیا گیا اور 5 μM ThT (حتمی ارتکاز) کے ساتھ ملایا گیا، کل نمونے کی حراستی 50 μl حجم۔نمونے ہر 10 منٹ پر 37 ° C پر سیل آبزرور (Zeiss) مائکروسکوپ پر ٹرانسمٹڈ لائٹ چینل اور FITC اتیجیت اور ThT امیجنگ کے لیے اخراج فلٹر سیٹ کے ساتھ امیج کیے گئے۔امیجنگ کے لیے 20x/0.4 لینس استعمال کیا جاتا ہے۔زین بلیو (Zeiss) اور ImageJ (https://imagej.nih.gov/) تصویری تجزیہ کے لیے استعمال کیے گئے تھے۔جیل بھی NT اور His-NT2RepCT سلوشنز سے 50 mg/mL کے ارتکاز میں تیار کیے گئے تھے جن میں 20 mM Tris pH 8 اور 5 µM ThT اور 90 منٹ کے لیے 37 ° C پر انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔جیل کے ٹکڑوں کو ایک نئے کنویں میں منتقل کیا گیا تھا جس میں 20 ایم ایم ٹریس، پی ایچ 8، اور 5 μM ThT ایک غیر بائنڈنگ بلیک 96 اچھی طرح سے صاف نیچے والی پلیٹ میں تھا۔20x/0.4 میگنیفیکیشن پر گرین فلوروسینس اور روشن فیلڈ امیجز حاصل کریں۔امیج جے کو تصویری تجزیہ کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔
حل NMR سپیکٹرا 310 K پر 600 MHz Bruker Avance Neo اسپیکٹرومیٹر پر حاصل کیا گیا جو QCI Quadrupole Resonance Pulsed Gradient Field Cryoprobe (HFCN) سے لیس ہے۔NMR نمونے جن میں 10 mg/mL یکساں پروٹین کا لیبل لگا ہوا 13C, 15N، 20 mM Tris-HCl (pH 8) میں تحلیل کیا گیا، 0.02% (w/v) NaN3، 5% DO (v/v)، (n = 1) .پی ایچ 6.7 پر NT2RepCT کی کیمیائی شفٹوں کو 15N-HSQC کے 2D سپیکٹرم میں چوٹی 23 تفویض کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔
13C کا جادوئی زاویہ گھومنے والا ٹھوس NMR (MAS) سپیکٹرا، 15N لیبل والے ہائیڈروجلز کو 800 MHz پر Bruker Avance III HD سپیکٹرومیٹر پر 3.2 mm 13C/15N{1H} الیکٹرون لیس پروب سے لیس ریکارڈ کیا گیا۔نمونہ کے درجہ حرارت کو 277 KHz پر متغیر درجہ حرارت گیس کے بہاؤ کا استعمال کرتے ہوئے کنٹرول کیا گیا۔ دو جہتی ڈوپول گردشی گونج (DARR) 76 اور ریڈیو فریکوئنسی ری کنکشن (RFDR) 77 سپیکٹرا بالترتیب 12.5 kHz اور 20 kHz کی MAS فریکوئنسیوں پر حاصل کیے گئے۔1H سے 13C تک کراس پولرائزیشن (CP) 1H پر 60.0 سے 48.0 kHz تک ایک لکیری ریمپ، 13C پر 61.3/71.6 kHz (12.5/20 kHz MAS پر) اور رابطہ وقت 0.5–1 ms کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا گیا۔ڈیٹا اکٹھا کرنے کے دوران 73.5 kHz پر Spinal6478 decoupling استعمال کیا گیا۔حصول کا وقت 10 ملی سیکنڈ اور سائیکل کی تاخیر 2.5 سیکنڈ تھی۔RFDR سپیکٹرا میں مشاہدہ کردہ سنگل لنکڈ Cα/Cβ ارتباط کو خصوصیت کی باقیات کی قسم کی کیمیائی شفٹوں اور DARR سپیکٹرا میں ضرب سے منسلک ارتباط کی بنیاد پر تفویض کیا گیا تھا۔
Zipper79 ڈیٹا بیس (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) کا استعمال NT، NTFlSp، اور NTMiSp کے لیے پھڑپھڑانے کے رجحانات اور روزیٹا توانائی کا جائزہ لینے کے لیے کیا گیا تھا۔زپر ڈیٹا بیس روزیٹا انرجی 80 کی گنتی کرتا ہے، جو پروٹین کے ڈھانچے کو ماڈل بنانے اور تجزیہ کرنے کے لیے کئی مفت توانائی کے افعال کو یکجا کرتا ہے۔توانائی کی سطح -23 کلو کیلوری/مول یا اس سے کم فیبریلیٹ کے اعلی رجحان کی نشاندہی کرتی ہے۔نچلی توانائی کا مطلب ہے زپ کنفارمیشن میں دو β اسٹرینڈز کا زیادہ استحکام۔اس کے علاوہ، والٹز الگورتھم کا استعمال NT، NTFlSp اور NTMiSp Ref میں amyloidogenic علاقوں کی پیش گوئی کرنے کے لیے کیا گیا تھا۔81. (https://waltz.switchlab.org/)۔
NT پروٹین محلول کو پی ایچ 5.5 اور 6.0 پر 2-(N-morpholino) ایتھین سلفونک ایسڈ (MES) بفر کے ساتھ ملایا گیا تاکہ pH کو بالترتیب pH 6 اور 7 تک کم کیا جا سکے۔حتمی پروٹین کی حراستی 100 ملی گرام / ملی لیٹر تھی۔
پیمائش J-1500 CD اسپیکٹومیٹر (JASCO، USA) پر 300 μL کیویٹ کا استعمال کرتے ہوئے 0.1 سینٹی میٹر کے نظری راستے کے ساتھ کی گئی۔20 ایم ایم فاسفیٹ بفر (پی ایچ 8) میں پروٹین کو 10 μM (n = 1) تک پتلا کیا گیا تھا۔نمک کی موجودگی میں پروٹین کے استحکام کا تجزیہ کرنے کے لیے، بالترتیب 154 ایم ایم NaF یا NaCl پر مشتمل 20 mM فاسفیٹ بفر (pH 8) میں اسی ارتکاز (n = 1) پر پروٹین کا تجزیہ کیا گیا۔درجہ حرارت اسکین 222 nm پر 25°C سے 95°C تک 1°C/منٹ کی حرارتی شرح کے ساتھ ریکارڈ کیا گیا۔مقامی طور پر فولڈ پروٹین کے تناسب کا حساب فارمولہ (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal) کے ذریعے کیا گیا تھا۔اس کے علاوہ، ہر نمونے کے لیے 260 nm سے 190 nm تک 25 ° C پر اور 95 ° C پر گرم کرنے کے بعد پانچ سپیکٹرا ریکارڈ کیے گئے۔پانچ سپیکٹرا کو اوسط کیا گیا، ہموار کیا گیا اور داڑھ بیضوی میں تبدیل کیا گیا۔پرزم 9 کا استعمال کرتے ہوئے ڈیٹا کا تجزیہ کیا گیا۔
His-NT-GFP (300 mg/mL, 80 µL) کی فلوروسینس کی شدت کو جامد حالات میں سیاہ شفاف نیچے (کارننگ گلاس 3881، USA) کے ساتھ 96 کنویں کارننگ پلیٹوں میں سہ رخی (n = 3) میں ماپا گیا۔فلوروسینس پر مبنی پلیٹ ریڈر کے ساتھ 395 nm کی حوصلہ افزائی طول موج کے ساتھ نمونوں کی پیمائش کریں اور اخراج کو جیلیشن سے پہلے 509 nm پر اور 2 گھنٹے بعد 37 ° C پر ریکارڈ کریں۔پرزم 9 کے ساتھ ڈیٹا کا تجزیہ کیا گیا۔
پیورین نیوکلیوسائیڈ فاسفوریلیس سرگرمی پرکھ کٹ (فلوروومیٹرک طریقہ، سگما ایلڈرچ) کارخانہ دار کی ہدایات کے مطابق استعمال کی گئی تھی۔His-NT-PNP پر مشتمل جیلوں اور محلولوں میں سرگرمی کی پیمائش کرنے کے لیے، His-NT-PNP کے 10 ng کو 100 mg/mL NT کے ساتھ 2 µL کے کل حجم میں مکس کریں کیونکہ جیل نے سیٹ کے پتہ لگانے کے وقفے سے اوپر ایک سگنل دیا تھا۔ہیز-NT-PNP کے بغیر جیل اور حل کے کنٹرول شامل تھے۔پیمائش دو بار کی گئی (n = 2)۔سرگرمی کی پیمائش کے بعد، رد عمل کا مرکب ہٹا دیا گیا اور جیل کی تصویر کشی کی گئی تاکہ یہ یقینی بنایا جا سکے کہ پیمائش کے دوران جیل برقرار رہے۔پرزم 9 کا استعمال کرتے ہوئے ڈیٹا کا تجزیہ کیا گیا۔
مطالعہ کے ڈیزائن کے بارے میں مزید معلومات کے لیے، اس مضمون سے منسلک نیچر اسٹڈی خلاصہ دیکھیں۔
اعداد و شمار 1 اور 2 ابتدائی ڈیٹا پیش کرتے ہیں۔1c، 2a–c، 3a، b، e–g، 4، 5b، d، f، اور 6، ضمنی انجیر۔3، ضمنی انجیر۔5a، d، ضمنی انجیر۔6 اور ضمنی انجیر۔8. اس مطالعہ کا ڈیٹا ڈیٹا زینوڈو ڈیٹا بیس https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653 میں ہوسٹ کیا گیا ہے۔اس مطالعہ میں حاصل کردہ NMR ڈیٹا کو BMRBig ذخیرہ میں انٹری ID bmrbig36 کے تحت پوسٹ کیا گیا تھا۔GFP اور PNP کے ڈھانچے PDB (GFP 2B3Q، PNP 4RJ2) سے لیے گئے تھے۔
رائزنگ، اے اور جوہانسن، جے مصنوعی مکڑی کا ریشم اسپننگ۔قومی کیمیکل۔حیاتیات.11، 309–315 (2015)۔
باب، پی ایل وغیرہ۔Nephila clavipes جینوم مکڑی کے ریشم کے جین کے تنوع اور ان کے پیچیدہ اظہار کو نمایاں کرتا ہے۔نیشنل جینیٹ۔49، 895–903 (2017)۔