304 سٹینلیس سٹیل ویلڈڈ کوائلڈ ٹیوب/ٹیوبنگ زیمیکل زومپوننٹ، گلوبل میرین مائیکرو بایوم کی بایوسینتھیٹک پوٹینشل

Nature.com پر جانے کا شکریہ۔آپ محدود سی ایس ایس سپورٹ کے ساتھ براؤزر کا ورژن استعمال کر رہے ہیں۔بہترین تجربے کے لیے، ہم تجویز کرتے ہیں کہ آپ ایک اپ ڈیٹ شدہ براؤزر استعمال کریں (یا انٹرنیٹ ایکسپلورر میں مطابقت موڈ کو غیر فعال کریں)۔اس کے علاوہ، جاری تعاون کو یقینی بنانے کے لیے، ہم سائٹ کو بغیر اسٹائل اور جاوا اسکرپٹ کے دکھاتے ہیں۔
سلائیڈرز فی سلائیڈ تین مضامین دکھا رہے ہیں۔سلائیڈوں کے ذریعے جانے کے لیے پیچھے اور اگلے بٹنوں کا استعمال کریں، یا ہر سلائیڈ سے گزرنے کے لیے آخر میں سلائیڈ کنٹرولر بٹن استعمال کریں۔

مصنوعات کی تفصیلی وضاحت

304 سٹینلیس سٹیل ویلڈیڈ کوائلڈ ٹیوب/نلیاں
1. تفصیلات: سٹینلیس سٹیل کنڈلی ٹیوب / نلیاں
2. قسم: ویلڈیڈ یا ہموار
3. معیاری: ASTM A269، ASTM A249
4. سٹینلیس سٹیل کوائل ٹیوب OD: 6mm سے 25.4MM
5. لمبائی: 600-3500MM یا کسٹمر کی ضرورت کے مطابق۔
6. دیوار کی موٹائی: 0.2 ملی میٹر سے 2.0 ملی میٹر۔

7. رواداری: OD: +/-0.01mm؛موٹائی: +/-0.01%

8. کنڈلی اندرونی سوراخ کا سائز: 500MM-1500MM (کسٹمر کی ضروریات کے مطابق ایڈجسٹ کیا جا سکتا ہے)

9. کنڈلی کی اونچائی: 200MM-400MM (کسٹمر کی ضروریات کے مطابق ایڈجسٹ کیا جا سکتا ہے)

10. سطح: روشن یا annealed
11. مواد: 304، 304L، 316L، 321، 301، 201، 202، 409، 430، 410، مصر 625، 825، 2205، 2507، وغیرہ۔
12. پیکنگ: بنے ہوئے تھیلے لکڑی کے کیس، لکڑی کے پیلیٹ، لکڑی کے شافٹ، یا گاہک کی ضرورت کے مطابق
13. ٹیسٹ: کیمیائی جزو، پیداوار کی طاقت، تناؤ کی طاقت، سختی کی پیمائش
14. گارنٹی: فریق ثالث (مثال کے طور پر: SGS TV) معائنہ وغیرہ۔
15. درخواست: سجاوٹ، فرنیچر، تیل کی نقل و حمل، ہیٹ ایکسچینجر، ریلنگ بنانا، کاغذ سازی، آٹوموبائل، فوڈ پروسیسنگ، میڈیکل وغیرہ۔

قدرتی مائکروبیل کمیونٹیز فائیلوجنیٹک اور میٹابولک طور پر متنوع ہیں۔جانداروں کے سمجھے ہوئے گروہوں کے علاوہ، یہ تنوع ماحولیاتی اور حیاتیاتی ٹیکنالوجی کے لحاظ سے اہم انزائمز اور بائیو کیمیکل مرکبات 2,3 کی دریافت کی بھی بھرپور صلاحیت رکھتا ہے۔تاہم، جینومک راستوں کا تعین کرنے کے لیے اس تنوع کا مطالعہ کرنا جو اس طرح کے مرکبات کی ترکیب کرتے ہیں اور انہیں ان کے متعلقہ میزبانوں سے جوڑتے ہیں۔کھلے سمندر میں مائکروجنزموں کی حیاتیاتی مصنوعی صلاحیت عالمی سطح پر پورے جینوم ریزولوشن ڈیٹا کے تجزیہ میں محدودیت کی وجہ سے بڑی حد تک نامعلوم ہے۔یہاں، ہم 1000 سے زیادہ سمندری پانی کے نمونوں سے 25,000 سے زیادہ نئے تعمیر شدہ ڈرافٹ جینوم کے ساتھ کلچرڈ سیلز اور سنگل سیلز سے تقریباً 10,000 مائکروبیل جینومز کو اکٹھا کر کے سمندر میں بائیو سنتھیٹک جین کلسٹرز کے تنوع اور تنوع کو تلاش کرتے ہیں۔ان کوششوں نے تقریباً 40,000 پوٹیٹیو زیادہ تر نئے بائیو سنتھیٹک جین کلسٹرز کی نشاندہی کی ہے، جن میں سے کچھ پہلے غیر مشتبہ فائیلوجنیٹک گروپس میں پائے گئے ہیں۔ان آبادیوں میں، ہم نے بائیو سنتھیٹک جین کلسٹرز ("کینڈیڈیٹس یوڈورمائکروبیاسی") میں افزودہ ایک نسب کی نشاندہی کی جس کا تعلق ایک غیر کاشت شدہ بیکٹیریل فیلم سے تھا اور اس ماحول میں حیاتیاتی طور پر متنوع مائکروجنزموں میں سے کچھ شامل تھے۔ان میں سے، ہم نے بالترتیب غیر معمولی بایو ایکٹیو کمپاؤنڈ ڈھانچے اور انزائمولوجی کی مثالوں کی نشاندہی کرتے ہوئے، فاسفیٹیز-پیپٹائڈ اور پائٹونامائڈ کے راستوں کی خصوصیت کی ہے۔آخر میں، یہ مطالعہ یہ ظاہر کرتا ہے کہ کس طرح مائیکرو بایوم پر مبنی حکمت عملی ناقص سمجھے جانے والے مائیکرو بائیوٹا اور ماحول میں پہلے سے بیان نہ کیے گئے انزائمز اور قدرتی کھانوں کی تلاش کے قابل بنا سکتی ہے۔
جرثومے عالمی جیو کیمیکل سائیکل چلاتے ہیں، کھانے کے جالوں کو برقرار رکھتے ہیں، اور پودوں اور جانوروں کو صحت مند رکھتے ہیں5۔ان کا بہت بڑا فائیلوجنیٹک، میٹابولک اور فنکشنل تنوع نئے ٹیکسا 1، انزائمز اور بائیو کیمیکل مرکبات بشمول قدرتی مصنوعات کی دریافت کی بھرپور صلاحیت کی نمائندگی کرتا ہے۔ماحولیاتی برادریوں میں، یہ مالیکیول مائکروجنزموں کو مختلف قسم کے جسمانی اور ماحولیاتی افعال فراہم کرتے ہیں، مواصلات سے مقابلے تک 2, 7۔اپنے اصل افعال کے علاوہ، یہ قدرتی مصنوعات اور ان کے جینیاتی طور پر کوڈ شدہ پیداواری راستے بائیو ٹیکنالوجی اور علاج معالجے کے لیے مثالیں فراہم کرتے ہیں 2,3۔مہذب جرثوموں کے مطالعہ سے اس طرح کے راستوں اور رابطوں کی شناخت میں بہت آسانی ہوئی ہے۔تاہم، قدرتی ماحول کے ٹیکسونومک اسٹڈیز سے یہ بات سامنے آئی ہے کہ مائکروجنزموں کی اکثریت کو کاشت نہیں کیا گیا ہے۔یہ ثقافتی تعصب بہت سے جرثوموں 4,9 کے ذریعے انکوڈ شدہ فنکشنل تنوع سے فائدہ اٹھانے کی ہماری صلاحیت کو محدود کرتا ہے۔
ان حدود پر قابو پانے کے لیے، پچھلی دہائی میں تکنیکی ترقی نے محققین کو براہ راست (یعنی بغیر کسی پیشگی ثقافت کے) پوری کمیونٹیز (میٹاجینومکس) یا واحد خلیات سے مائکروبیل ڈی این اے کے ٹکڑوں کو ترتیب دینے کی اجازت دی ہے۔ان ٹکڑوں کو بڑے جینوم کے ٹکڑوں میں جمع کرنے اور بالترتیب ایک سے زیادہ میٹاجینومیکل اسمبلڈ جینوم (MAGs) یا سنگل ایمپلیفائیڈ جینوم (SAGs) کو دوبارہ تشکیل دینے کی صلاحیت مائکرو بایوم (یعنی مائکروبیل کمیونٹیز اور مائکرو بایوم) کے ٹیکس سینٹرک اسٹڈیز کے لیے ایک اہم موقع کھولتی ہے۔نئی راہیں ہموار کریں.دیئے گئے ماحول میں اپنا جینیاتی مواد) 10,11,12۔درحقیقت، حالیہ مطالعات نے ارتھ 1، 13 پر مائکروبیل تنوع کی فائیلوجنیٹک نمائندگی کو بہت بڑھایا ہے اور انفرادی مائکروبیل کمیونٹیز میں زیادہ تر فعال تنوع کا انکشاف کیا ہے جو پہلے مہذب مائکروجنزم ریفرنس جینوم سیکوینس (REFs) 14 میں شامل نہیں تھے۔میزبان جینوم (یعنی جینوم ریزولوشن) کے تناظر میں غیر دریافت شدہ فنکشنل تنوع کو رکھنے کی صلاحیت ابھی تک غیر مخصوص مائکروبیل لائنوں کی پیش گوئی کرنے کے لئے اہم ہے جو ممکنہ طور پر نئی قدرتی مصنوعات کو انکوڈ کرتی ہیں 15,16 یا اس طرح کے مرکبات کو ان کے اصل پروڈیوسر تک واپس لانے کے لئے۔مثال کے طور پر، ایک مشترکہ میٹاجینومک اور سنگل سیل جینومک تجزیہ کے نقطہ نظر کی وجہ سے کینڈیڈیٹس اینٹوتھیونیلا کی شناخت ہوئی ہے، جو کہ میٹابولک طور پر بھرپور اسفنج سے وابستہ بیکٹیریا کا ایک گروپ ہے، جو کہ مختلف قسم کی دوائیوں کی صلاحیتوں کے پروڈیوسر کے طور پر ہے۔تاہم، متنوع مائکروبیل کمیونٹیز کی جینومک ریسرچ کی حالیہ کوششوں کے باوجود، 16,19 ماحولیاتی نظام کے زمین کے سب سے بڑے سمندر کے لیے عالمی میٹاجینومک ڈیٹا کا دو تہائی سے زیادہ 16,20 ابھی تک غائب ہے۔اس طرح، عام طور پر، سمندری مائکرو بایوم کی بایو سنتھیٹک صلاحیت اور ناول انزیمیٹک اور قدرتی مصنوعات کے ذخیرے کے طور پر اس کی صلاحیت کو بڑی حد تک کم سمجھا جاتا ہے۔
عالمی سطح پر سمندری مائیکروبائیومز کی بایو سنتھیٹک صلاحیت کو دریافت کرنے کے لیے، ہم نے سب سے پہلے کلچر پر منحصر اور غیر ثقافتی طریقوں کا استعمال کرتے ہوئے حاصل کیے گئے سمندری مائکروبیل جینومز کو جمع کیا تاکہ فائیلوجنیٹکس اور جین فنکشن کا ایک وسیع ڈیٹا بیس بنایا جا سکے۔اس ڈیٹا بیس کی جانچ سے مختلف قسم کے بائیو سنتھیٹک جین کلسٹرز (BGCs) کا انکشاف ہوا، جن میں سے بیشتر کا تعلق ابھی تک غیر مخصوص جین کلسٹر (GCF) خاندانوں سے ہے۔اس کے علاوہ، ہم نے ایک نامعلوم بیکٹیریل خاندان کی نشاندہی کی جو آج تک کھلے سمندر میں BGCs کے سب سے زیادہ معروف تنوع کو ظاہر کرتا ہے۔ہم نے تجرباتی توثیق کے لیے دو رائبوسومل ترکیب اور پوسٹ ٹرانسلیشنلی موڈیفائیڈ پیپٹائڈ (RiPP) راستے منتخب کیے جو موجودہ معلوم راستوں سے ان کے جینیاتی فرق کی بنیاد پر ہیں۔ان راستوں کی فنکشنل خصوصیات نے انزائمولوجی کی غیر متوقع مثالوں کے ساتھ ساتھ پروٹیز روکنے والی سرگرمی کے ساتھ ساختی طور پر غیر معمولی مرکبات کا انکشاف کیا ہے۔
سب سے پہلے، ہم نے جینوم کے تجزیے کے لیے ایک عالمی ڈیٹا کا وسیلہ بنانا، اس کے بیکٹیریل اور آثار قدیمہ کے اجزاء پر توجہ مرکوز کرنا تھا۔اس مقصد کے لیے، ہم نے 215 عالمی سطح پر تقسیم شدہ نمونے لینے والی جگہوں سے میٹاجینومک ڈیٹا اور 1038 سمندری پانی کے نمونے جمع کیے (طول بلد کی حد = 141.6°) اور کئی گہری تہیں (1 سے 5600 میٹر گہرائی تک، پیلاجک، میسوپیلاجک اور ابیسیل زون کا احاطہ کرتی ہیں)۔پس منظر21,22,23 (تصویر 1a، توسیعی ڈیٹا، تصویر 1a اور ضمنی جدول 1)۔وسیع جغرافیائی کوریج فراہم کرنے کے علاوہ، ان منتخب طور پر فلٹر کیے گئے نمونوں نے ہمیں سمندری مائکرو بایوم کے مختلف اجزاء کا موازنہ کرنے کی اجازت دی، بشمول وائرس سے بھرپور (<0.2 µm)، پراکاریوٹک سے بھرپور (0.2–3 µm)، ذرہ سے بھرپور (0.8 µm) )۔-20 µm) اور وائرس سے محروم (>0.2 µm) کالونیاں۔
a، 215 عالمی سطح پر تقسیم شدہ مقامات (62°S سے 79°N اور 179°W سے 179°E) سے جمع کردہ سمندری مائکروبیل کمیونٹیز کے کل 1038 عوامی طور پر دستیاب جینوم (میٹاجینومکس)۔نقشہ ٹائل © Esri.ذرائع: GEBCO, NOAA, CHS, OSU, UNH, CSUMB, National Geographic, DeLorme, NAVTEQ, اور Esri۔b، یہ میٹاجینوم MAGs (طریقے اور اضافی معلومات) کی تشکیل نو کے لیے استعمال کیے گئے تھے، جو ڈیٹاسیٹس (رنگ میں نشان زد) میں مقدار اور معیار (طریقے) میں مختلف ہیں۔دوبارہ تعمیر شدہ MAGs کو عوامی طور پر دستیاب (بیرونی) جینوم کے ساتھ پورا کیا گیا تھا، بشمول دستکاری MAG26، SAG27 اور REF۔27 OMD مرتب کریں۔c، صرف SAG (GORG)20 یا MAG (GEM)16 پر مبنی پچھلی رپورٹوں کے مقابلے میں، OMD سمندری مائکروبیل کمیونٹیز کی جینومک خصوصیات کو بہتر بناتا ہے (میٹاجینومک ریڈ میپنگ کی شرح؛ طریقہ) گہرائی میں زیادہ مستقل نمائندگی کے ساتھ دو سے تین گنا زیادہ طول..<0.2, n=151, 0.2-0.8, n=67, 0.2-3, n=180, 0.8-20, n=30, >0.2, n=610, <30°, n = 132, 30–60° , n = 73, >60°, n = 42, EPI, n = 174, MES, n = 45, BAT, n = 28. d, OMD کو پرجاتیوں کے جھرمٹ کی سطح میں گروپ بندی (95% مطلب نیوکلیوٹائڈ شناخت) کل کی شناخت کرتا ہے تقریباً 8300 پرجاتیوں، جن میں سے نصف سے زیادہ پہلے جی ٹی ڈی بی (ورژن 89) ای کا استعمال کرتے ہوئے ٹیکسونومک تشریحات کے مطابق خصوصیات نہیں دی گئی ہیں، جینوم کی قسم کے لحاظ سے پرجاتیوں کی درجہ بندی سے پتہ چلتا ہے کہ MAG، SAG اور REFs ایک دوسرے کے فائیلوجنیٹک تنوع کی عکاسی کرنے میں اچھی طرح سے تکمیل کرتے ہیں۔ سمندری مائکروبیوم.خاص طور پر، بالترتیب MAG، SAG اور REF کے لیے 55%، 26% اور 11% انواع مخصوص تھیں۔BATS، برمودا اٹلانٹک ٹائم سیریز؛GEM، زمین کے مائکرو بایوم کے جینوم؛GORG، عالمی سمندری حوالہ جینوم؛ہاٹ، ہوائی اوشین ٹائم سیریز۔
اس ڈیٹاسیٹ کا استعمال کرتے ہوئے، ہم نے کل 26,293 MAGs کی تشکیل نو کی، زیادہ تر بیکٹیریل اور آرکیئل (تصویر 1b اور توسیع شدہ ڈیٹا، تصویر 1b)۔ہم نے ان MAGs کو مختلف مقامات یا ٹائم پوائنٹس (طریقوں) کے نمونوں کے درمیان قدرتی ترتیب کے تغیر کے خاتمے کو روکنے کے لیے جمع شدہ میٹاجینومک نمونوں کی بجائے الگ سے اسمبلیوں سے بنایا ہے۔اس کے علاوہ، ہم نے بڑی تعداد میں نمونوں میں ان کے پھیلاؤ کے ارتباط کی بنیاد پر جینومک ٹکڑوں کو گروپ کیا (58 سے 610 نمونوں تک، سروے پر منحصر ہے؛ طریقہ)۔ہم نے پایا کہ یہ ایک وقت طلب لیکن اہم مرحلہ ہے 24 جسے کئی بڑے پیمانے پر MAG16, 19, 25 تعمیر نو کے کاموں میں چھوڑ دیا گیا اور اس کی مقدار (اوسطاً 2.7 گنا) اور معیار (اوسطاً +20%) میں نمایاں بہتری آئی۔ جینومیہاں زیر مطالعہ میرین میٹاجینوم سے دوبارہ تشکیل دیا گیا (توسیع شدہ ڈیٹا، تصویر 2a اور اضافی معلومات)۔مجموعی طور پر، ان کوششوں کے نتیجے میں سمندری مائکروبیل MAGs میں 4.5 گنا اضافہ ہوا (6 گنا اگر صرف اعلیٰ معیار کے MAGs پر غور کیا جائے) آج کل دستیاب سب سے جامع MAG وسائل16 (طریقے) کے مقابلے میں۔اس نئے بنائے گئے MAG سیٹ کو پھر 830 ہاتھ سے چنے ہوئے MAG26s، 5969 SAG27s اور 1707 REFs کے ساتھ ملایا گیا۔سمندری بیکٹیریا اور آثار قدیمہ کی ستائیس انواع نے 34,799 جینوم کا ایک مجموعہ بنایا (تصویر 1b)۔
اس کے بعد ہم نے سمندری مائکروبیل کمیونٹیز کی نمائندگی کرنے کی صلاحیت کو بہتر بنانے اور جینوم کی مختلف اقسام کے انضمام کے اثرات کا جائزہ لینے کے لیے نئے بنائے گئے وسائل کا جائزہ لیا۔اوسطاً، ہم نے پایا کہ یہ تقریباً 40-60% سمندری میٹاجینومک ڈیٹا (شکل 1c) کا احاطہ کرتا ہے، گہرائی اور عرض بلد دونوں میں صرف MAG-صرف رپورٹوں کی کوریج سے دو سے تین گنا زیادہ سیریل 16 یا SAG20۔اس کے علاوہ، منظم طریقے سے قائم کردہ مجموعوں میں ٹیکسونومک تنوع کی پیمائش کرنے کے لیے، ہم نے جینوم ٹیکسونومی ڈیٹا بیس (GTDB) ٹول کٹ (طریقے) کا استعمال کرتے ہوئے تمام جینوم کی تشریح کی اور 95٪ کی اوسط جینوم وسیع نیوکلیوٹائڈ شناخت کا استعمال کیا۔8,304 پرجاتیوں کے کلسٹرز (پرجاتیوں) کی شناخت کے لیے 28۔ان میں سے دو تہائی انواع (بشمول نئے کلیڈز) پہلے جی ٹی ڈی بی میں نمودار نہیں ہوئی تھیں، جن میں سے 2790 کو اس تحقیق میں دوبارہ تشکیل شدہ MAG کا استعمال کرتے ہوئے دریافت کیا گیا تھا (تصویر 1d)۔اس کے علاوہ، ہم نے پایا کہ جینوم کی مختلف اقسام انتہائی تکمیلی ہیں: 55%، 26%، اور 11% انواع بالترتیب MAG، SAG، اور REF پر مشتمل ہیں (تصویر 1e)۔اس کے علاوہ، MAG نے پانی کے کالم میں پائی جانے والی تمام 49 اقسام کا احاطہ کیا، جبکہ SAG اور REF نے بالترتیب صرف 18 اور 11 کی نمائندگی کی۔تاہم، SAG سب سے زیادہ عام کلیڈز (توسیع شدہ ڈیٹا، تصویر 3a) کے تنوع کی بہتر نمائندگی کرتا ہے، جیسے پیلاجک بیکٹیریا (SAR11)، جس میں SAG تقریباً 1300 پرجاتیوں اور MAG صرف 390 پرجاتیوں کا احاطہ کرتا ہے۔خاص طور پر، REFs شاذ و نادر ہی انواع کی سطح پر MAGs یا SAGs کے ساتھ اوورلیپ ہوتے ہیں اور یہاں زیر مطالعہ کھلے سمندر کے میٹاجینومک سیٹوں میں نہیں پائے جانے والے تقریباً 1000 جینومز میں سے 95% کی نمائندگی کرتے ہیں، بنیادی طور پر دیگر اقسام کے الگ تھلگ نمائندہ سمندری نمونوں (مثلاً تلچھٹ) کے ساتھ تعامل کی وجہ سے۔ .یا میزبان کے ساتھی)۔اسے سائنسی برادری کے لیے وسیع پیمانے پر دستیاب کرنے کے لیے، اس سمندری جینوم کے وسائل، جس میں غیر درجہ بند ٹکڑے بھی شامل ہیں (مثلاً، پیش گوئی شدہ فیز، جینومک جزیروں، اور جینوم کے ٹکڑے جن کے لیے MAG کی تعمیر نو کے لیے ناکافی ڈیٹا موجود ہے) کا موازنہ ٹیکسونومک ڈیٹا سے کیا جا سکتا ہے۔ .Ocean Microbiology Database (OMD؛ https://microbiomics.io/ocean/) میں جین فنکشن اور سیاق و سباق کے پیرامیٹرز کے ساتھ تشریحات تک رسائی حاصل کریں۔
اس کے بعد ہم کھلے سمندر کے مائکرو بایوم میں بایو سنتھیٹک صلاحیت کی فراوانی اور نیاپن کو تلاش کرنے کے لیے نکلے۔اس مقصد کے لیے، ہم نے پہلے تمام MAGs، SAGs، اور REFs کے لیے antiSMASH کا استعمال کیا جو 1038 میرین میٹاجینوم (طریقوں) میں پائے گئے تاکہ کل 39,055 BGCs کی پیشن گوئی کی جا سکے۔اس کے بعد ہم نے ان کو 6907 غیر فالتو GCFs اور 151 جین کلسٹر آبادی (GCCs؛ ضمنی جدول 2 اور طریقوں) میں گروپ کیا تاکہ موروثی فالتو پن (یعنی ایک ہی BGC کو ایک سے زیادہ جینوم میں انکوڈ کیا جا سکے) اور BGC کی ارتکاز کی میٹجینومک ڈیٹا فریگمنٹیشن۔نامکمل BGCs میں کوئی خاص اضافہ نہیں ہوا، اگر کوئی ہے (ضمنی معلومات)، بالترتیب GCFs اور GCCs کی تعداد، 44% اور 86% معاملات میں کم از کم ایک برقرار BGC ممبر پر مشتمل ہے۔
جی سی سی کی سطح پر، ہم نے پیشین گوئی شدہ RiPPs اور دیگر قدرتی مصنوعات کی وسیع اقسام پائی (تصویر 2a)۔ان میں، مثال کے طور پر، ایرلپولینز، کیروٹینائڈز، ایکٹوئنز، اور سائڈروفورس کا تعلق جی سی سی سے ہے جس میں وسیع فائیلوجنیٹک تقسیم ہے اور سمندری میٹاجینوم میں زیادہ کثرت ہے، جو سمندری ماحول میں مائکروجنزموں کی وسیع موافقت کی نشاندہی کر سکتی ہے، بشمول رد عمل آکسیجن کے خلاف مزاحمت۔ آکسیڈیٹیو اور اوسموٹک تناؤ۔.یا لوہے کا جذب (مزید معلومات)۔یہ فنکشنل تنوع NCBI RefSeq ڈیٹا بیس (BiG-FAM/RefSeq، اس کے بعد RefSeq کے طور پر بھیجا جاتا ہے) میں ذخیرہ شدہ تقریباً 190,000 جینوموں میں سے تقریباً 1.2 ملین BGCs کے حالیہ تجزیے سے متصادم ہے۔ ide synthase (PKS) BGCs (ضمنی معلومات)۔ہمیں 44 (29%) GCCs بھی ملے ہیں جو صرف کسی بھی RefSeq BGC (\(\bar{d}\)RefSeq > 0.4 سے متعلق ہیں OMD میں پہلے سے غیر بیان شدہ کیمیکلز کا پتہ لگانے کے لیے۔یہ دیکھتے ہوئے کہ ان میں سے ہر ایک جی سی سی ممکنہ طور پر متنوع بایو سنتھیٹک افعال کی نمائندگی کرتا ہے، ہم نے اسی طرح کی قدرتی مصنوعات کے لیے کوڈ کی پیش گوئی کی گئی BGCs کی مزید تفصیلی گروپ بندی فراہم کرنے کی کوشش میں GCF سطح پر ڈیٹا کا مزید تجزیہ کیا۔کل 3861 (56%) شناخت شدہ GCFs RefSeq کے ساتھ اوورلیپ نہیں ہوئے، اور >97% GCFs MIBiG میں موجود نہیں تھے، تجرباتی طور پر توثیق شدہ BGCs کے سب سے بڑے ڈیٹا بیس میں سے ایک (شکل 2b)۔اگرچہ سیٹنگز میں ایسے بہت سے ممکنہ ناول پاتھ ویز کا دریافت کرنا حیران کن نہیں ہے جن کی ریفرینس جینوم کے ذریعہ اچھی طرح سے نمائندگی نہیں کی گئی ہے، لیکن بینچ مارکنگ سے پہلے BGCs کو GCFs میں نقل کرنے کا ہمارا طریقہ پچھلی رپورٹس 16 سے مختلف ہے اور ہمیں نیاپن کا غیر جانبدارانہ جائزہ فراہم کرنے کی اجازت دیتا ہے۔زیادہ تر نیا تنوع (3012 GCF یا 78%) پیش گوئی شدہ terpenes، RiPP یا دیگر قدرتی مصنوعات سے مساوی ہے، اور زیادہ تر (1815 GCF یا 47%) ان کی بایو سنتھیٹک صلاحیت کی وجہ سے نامعلوم اقسام میں انکوڈ کیے گئے ہیں۔PKS اور NRPS کلسٹرز کے برعکس، یہ کمپیکٹ BGCs کے میٹجینومک اسمبلی 31 کے دوران بکھرے ہونے کا امکان کم ہوتا ہے اور یہ ان کی مصنوعات کی زیادہ وقت اور وسائل سے متعلق فنکشنل خصوصیات کی اجازت دیتے ہیں۔
کل 39,055 BGCs کو 6,907 GCFs اور 151 GCCs میں تقسیم کیا گیا تھا۔a، ڈیٹا کی نمائندگی (اندرونی بیرونی)۔GCC پر مبنی BGC فاصلوں کا درجہ بندی کا جھرمٹ، جن میں سے 53 صرف MAG کے ذریعے طے کیے گئے ہیں۔جی سی سی میں مختلف ٹیکسا (ایل این-ٹرانسفارمڈ گیٹ فریکوئنسی) اور مختلف بی جی سی کلاسز (دائرہ کا سائز اس کی فریکوئنسی کے مساوی ہے) کے BGCs پر مشتمل ہے۔ہر GCC کے لیے، بیرونی پرت BGCs کی تعداد، پھیلاؤ (نمونوں کا فیصد) اور فاصلہ (کم سے کم BGC کوزائن فاصلہ (min(dMIBiG))) BiG-FAM سے BGC تک کی نمائندگی کرتی ہے۔تجرباتی طور پر تصدیق شدہ BGCs (MIBiG) سے قریبی تعلق رکھنے والے BGCs کے ساتھ GCCs کو تیر کے ساتھ نمایاں کیا گیا ہے۔b پیشن گوئی شدہ (BiG-FAM) اور تجرباتی طور پر توثیق شدہ (MIBiG) BGCs کے ساتھ GCF کا موازنہ کرتے ہوئے، 3861 نئے (d–>0.2) GCF پائے گئے۔ان میں سے زیادہ تر (78%) RiPP، terpenes، اور دیگر پوٹیٹیو قدرتی مصنوعات کے لیے۔c، 1038 میرین میٹاجینوم میں پائے جانے والے OMD کے تمام جینومز کو OMD کی فائیلوجنیٹک کوریج دکھانے کے لیے GTDB بیس ٹری میں رکھا گیا تھا۔OMD میں بغیر کسی جینوم کے کلیڈز کو بھوری رنگ میں دکھایا گیا ہے۔BGCs کی تعداد دیے گئے کلیڈ میں فی جینوم کی پیش گوئی شدہ BGCs کی سب سے بڑی تعداد کے مساوی ہے۔وضاحت کے لیے، آخری 15% نوڈس منہدم ہو گئے ہیں۔تیر BGC (> 15 BGC) سے بھرپور کلیڈز کی نشاندہی کرتے ہیں، ماسوائے مائکوبیکٹیریم، گورڈونیا (صرف روڈوکوکس کے بعد دوسرا)، اور کروکوسفیرا (صرف Synechococcus کے بعد دوسرا)۔d، نامعلوم c.Eremiobacterota نے سب سے زیادہ بایو سنتھیٹک تنوع ظاہر کیا (قدرتی مصنوعات کی قسم پر مبنی شینن انڈیکس)۔ہر بینڈ پرجاتیوں میں سب سے زیادہ BGCs کے ساتھ جینوم کی نمائندگی کرتا ہے۔T1PKS، PKS قسم I، T2/3PKS، PKS قسم II اور قسم III۔
فراوانی اور نیاپن کے علاوہ، ہم سمندری مائکرو بایوم کی بایو سنتھیٹک صلاحیت کے جیو جغرافیائی ڈھانچے کو بھی تلاش کرتے ہیں۔اوسط میٹاجینومک جی سی ایف کاپی نمبر ڈسٹری بیوشن (طریقوں) کے ذریعہ نمونوں کی گروپ بندی سے پتہ چلتا ہے کہ کم عرض بلد، سطح، پروکاریوٹک سے بھرپور اور وائرس سے متاثرہ کمیونٹیز، زیادہ تر سطح یا سورج کی روشنی کے گہرے پانیوں سے، RiPP اور BGC terpenes سے بھرپور تھیں۔اس کے برعکس، قطبی، گہرے سمندر، وائرس- اور ذرات سے بھرپور کمیونٹیز NRPS اور PKS BGC (توسیع شدہ ڈیٹا، تصویر 4 اور اضافی معلومات) کی زیادہ کثرت سے وابستہ تھیں۔آخر میں، ہم نے پایا کہ اچھی طرح سے زیر مطالعہ اشنکٹبندیی اور پیلاجک کمیونٹیز نئے ٹیرپینز (Augmented Data Figure) کے سب سے زیادہ امید افزا ذرائع ہیں۔PKS، RiPP اور دیگر قدرتی مصنوعات کے لیے سب سے زیادہ صلاحیت (توسیع شدہ ڈیٹا کے ساتھ شکل 5a)۔
سمندری مائکرو بایوم کی بایو سنتھیٹک صلاحیت کے ہمارے مطالعے کی تکمیل کے لیے، ہمارا مقصد ان کی فائیلوجنیٹک تقسیم کا نقشہ بنانا اور نئے BGC سے افزودہ کلیڈز کی شناخت کرنا تھا۔اس مقصد کے لیے، ہم نے سمندری جرثوموں کے جینومز کو ایک نارملائزڈ GTDB13 بیکٹیریل اور آرکیئل فائیلوجنیٹک درخت میں رکھا اور ان کو انکوڈ کرنے والے پوٹیٹیو بائیو سنتھیٹک راستے (تصویر 2c) پر چڑھایا۔ہم نے آسانی سے سمندری پانی کے نمونوں (طریقوں) میں کئی BGC سے افزودہ کلیڈس (جس کی نمائندگی 15 سے زیادہ BGCs) کی ہے جو ان کی بایو سنتھیٹک صلاحیت کے لیے جانا جاتا ہے، جیسے کہ سائینو بیکٹیریا (Synechococcus) اور پروٹیئس بیکٹیریا، جیسے Tistrella32,33، یا حال ہی میں ان کے لیے توجہ مبذول کروائی گئی ہے۔ قدرتی مصنوعات.جیسے Myxococcota (Sandaracinaceae)، Rhodococcus اور Planctomycetota34,35,36.دلچسپ بات یہ ہے کہ ہمیں ان کلیڈز میں کئی پہلے غیر دریافت شدہ نسب ملے۔مثال کے طور پر، فائیلا پلانکٹومیسیٹوٹا اور مائکسوکوکوٹا میں سب سے زیادہ بایو سنتھیٹک صلاحیت کے حامل وہ انواع کا تعلق بالترتیب غیر مخصوص امیدواروں کے آرڈرز اور جینرا سے تھا (ضمنی جدول 3)۔ایک ساتھ لے کر، یہ بتاتا ہے کہ OMD پہلے سے نامعلوم فائیلوجنیٹک معلومات تک رسائی فراہم کرتا ہے، بشمول مائکروجنزم، جو انزائم اور قدرتی مصنوعات کی دریافت کے لیے نئے اہداف کی نمائندگی کر سکتے ہیں۔
اس کے بعد، ہم نے BGC سے افزودہ کلیڈ کو نہ صرف اس کے اراکین کے ذریعے انکوڈ کیے ہوئے BGCs کی زیادہ سے زیادہ تعداد کو شمار کرکے، بلکہ ان BGCs کے تنوع کا اندازہ لگا کر، جو کہ قدرتی امیدوار مصنوعات کی مختلف اقسام کی تعدد کی وضاحت کرتا ہے (تصویر 2c اور طریقے۔ )۔.ہم نے پایا کہ اس مطالعے میں سب سے زیادہ حیاتیاتی طور پر متنوع پرجاتیوں کی نمائندگی خاص طور پر انجینئرڈ بیکٹیریل MAGs کے ذریعہ کی گئی تھی۔یہ بیکٹیریا غیر کاشت شدہ فیلم Candidatus Eremiobacterota سے تعلق رکھتے ہیں، جو کچھ جینومک مطالعات کے علاوہ بڑی حد تک غیر دریافت شدہ رہتا ہے 37,38۔یہ قابل ذکر ہے کہ "ca.Eremiobacterota جینس کا صرف ایک زمینی ماحول میں تجزیہ کیا گیا ہے اور BGC میں افزودہ کسی بھی ممبر کو شامل کرنے کے لیے معلوم نہیں ہے۔یہاں ہم نے ایک ہی نوع کے آٹھ MAGs (نیوکلیوٹائڈ شناخت > 99%) کو دوبارہ تشکیل دیا ہے 23۔ اس لیے ہم نے انواع کا نام "Candidatus Eudoremicrobium malaspinii" تجویز کیا ہے، جس کا نام نیریڈ (سمندری اپسرا) کے نام پر رکھا گیا ہے، جو یونانی افسانوں اور مہمات میں ایک خوبصورت تحفہ ہے۔'کا۔فائیلوجینیٹک تشریح 13 کے مطابق، E. malaspinii کا پہلے سے معلوم رشتہ دار نہیں ہے جو ترتیب کی سطح سے نیچے ہے اور اس طرح ایک نئے بیکٹیریل خاندان سے تعلق رکھتا ہے جسے ہم "Ca.E. malaspinii" بطور قسم کی نوع اور "Ca.Eudormicrobiaceae" بطور سرکاری نام (اضافی معلومات)۔'Ca کی مختصر میٹجینومک تعمیر نو۔E. malaspinii جینوم پروجیکٹ کی توثیق بہت کم ان پٹ، طویل پڑھی جانے والی میٹجینومک ترتیب اور ایک واحد نمونے (طریقوں) کی ٹارگٹڈ اسمبلی کے ذریعہ ایک سنگل 9.63 Mb لکیری کروموسوم کے ساتھ 75 kb نقل کے ساتھ کی گئی۔صرف باقی ابہام کے طور پر.
اس نوع کے فائیلوجنیٹک سیاق و سباق کو قائم کرنے کے لیے، ہم نے ٹارگیٹڈ جینوم کی تعمیر نو کے ذریعے تارا اوقیانوس مہم سے اضافی یوکرائیوٹک سے افزودہ میٹاجینومک نمونوں میں 40 قریب سے متعلقہ پرجاتیوں کی تلاش کی۔مختصراً، ہم نے میٹجینومک ریڈز کو "Ca سے منسلک جینومک ٹکڑوں سے جوڑا ہے۔E. malaspinii" اور قیاس کیا کہ اس نمونے میں بھرتی کی بڑھتی ہوئی شرح دوسرے رشتہ داروں (طریقوں) کی موجودگی کی نشاندہی کرتی ہے۔نتیجے کے طور پر، ہمیں 10 MAGs ملے، جو 19 MAGs کا مجموعہ ہے جو ایک نئے متعین خاندان (یعنی "Ca. Eudormicrobiaceae") میں تین نسلوں میں پانچ پرجاتیوں کی نمائندگی کرتا ہے۔دستی معائنہ اور کوالٹی کنٹرول کے بعد (توسیع شدہ ڈیٹا، تصویر 6 اور اضافی معلومات)، ہم نے پایا کہ "Ca.Eudormicrobiaceae پرجاتیوں میں دوسرے "Ca" اراکین کے مقابلے میں بڑے جینوم (8 Mb) اور امیر بایو سنتھیٹک صلاحیت (14 سے 22 BGC فی پرجاتی) موجود ہے۔Clade Eremiobacterota (7 BGC تک) (تصویر 3a–c)۔
a، پانچ 'Ca کی فائیلوجنیٹک پوزیشنز۔Eudormicrobiaceae کی پرجاتیوں نے اس مطالعے میں نشاندہی کی گئی سمندری خطوط سے مخصوص BGC کی بھرپوریت ظاہر کی۔فائیلوجنیٹک درخت میں تمام 'Ca' شامل ہیں۔MAG Eremiobacterota اور GTDB (ورژن 89) میں فراہم کردہ دیگر فائیلا (بریکٹ میں جینوم نمبر) کے ارکان کو ارتقائی پس منظر (طریقے) کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔سب سے باہر کی تہیں خاندانی سطح پر درجہ بندی کی نمائندگی کرتی ہیں ("Ca. Eudormicrobiaceae" اور "Ca. Xenobiaceae") اور طبقاتی سطح پر ("Ca. Eremiobacteria")۔اس مطالعہ میں بیان کردہ پانچ پرجاتیوں کی نمائندگی حروف نمبری کوڈز اور مجوزہ دو ناموں (اضافی معلومات) کے ذریعے کی گئی ہے۔ب، ٹھیک ہے۔Eudormicrobiaceae پرجاتیوں میں سات مشترکہ BGC نیوکللی ہیں۔A2 کلیڈ میں BGC کی عدم موجودگی نمائندہ MAG (ضمنی جدول 3) کے نامکمل ہونے کی وجہ سے تھی۔BGCs مخصوص ہیں "Ca.Amphithomicrobium" اور "Ca.Amphithomicrobium" (کلیڈ A اور B) نہیں دکھائے گئے ہیں۔c، تمام BGCs کو "Ca.Eudoremicrobium taraoceanii کا اظہار تارا کے سمندروں سے لیے گئے 623 میٹا ٹرانسکرپٹومز میں پایا گیا۔ٹھوس حلقے فعال نقل کی نشاندہی کرتے ہیں۔اورنج حلقے ہاؤس کیپنگ جین ایکسپریشن ریٹ (طریقے) کے نیچے اور اوپر لاگ 2 میں تبدیل شدہ فولڈ تبدیلیوں کی نشاندہی کرتے ہیں۔d، نسبتا کثرت کے منحنی خطوط (طریقے) 'Ca دکھا رہے ہیں۔Eudormicrobiaceae کی انواع زیادہ تر سمندری طاسوں اور پانی کے پورے کالم میں (سطح سے کم از کم 4000 میٹر کی گہرائی تک) میں پھیلی ہوئی ہیں۔ان تخمینوں کی بنیاد پر، ہم نے پایا کہ 'Ca.E. malaspinii' گہرے سمندر کے پیلاجک اناج سے وابستہ کمیونٹیز میں پروکاریوٹک خلیوں کا 6% تک کا حصہ ہے۔ہم نے ایک پرجاتیوں کو کسی سائٹ پر موجود سمجھا اگر یہ دی گئی گہرائی کی پرت کے سائز کے کسی بھی حصے میں پائی جاتی ہے۔IO - بحر ہند، NAO - شمالی بحر اوقیانوس، NPO - شمالی بحر الکاہل، RS - بحیرہ احمر، SAO - جنوبی بحر اوقیانوس، SO - جنوبی بحر، SPO - جنوبی بحر الکاہل۔
Ca کی کثرت اور تقسیم کا مطالعہ کرنا۔Eudormicrobiaceae، جیسا کہ ہم نے پایا، زیادہ تر سمندری طاسوں کے ساتھ ساتھ پانی کے پورے کالم (تصویر 3d) میں غالب ہے۔مقامی طور پر، وہ سمندری مائکروبیل کمیونٹی کا 6% بناتے ہیں، جو انہیں عالمی سمندری مائکروبیوم کا ایک اہم حصہ بناتے ہیں۔اس کے علاوہ، ہمیں Ca کا متعلقہ مواد ملا۔Eudormicrobiaceae پرجاتیوں اور ان کے BGC اظہار کی سطح یوکرائیوٹک افزودہ فریکشن (تصویر 3c اور توسیعی اعداد و شمار، تصویر 7) میں سب سے زیادہ تھی، جو پلاکٹن سمیت ذرات کے ساتھ ممکنہ تعامل کی نشاندہی کرتی ہے۔یہ مشاہدہ 'Ca' سے کچھ مشابہت رکھتا ہے۔Eudoremicrobium BGCs جو کہ معلوم راستوں کے ذریعے سائٹوٹوکسک قدرتی مصنوعات تیار کرتے ہیں، شکاری رویے کی نمائش کر سکتے ہیں (ضمنی معلومات اور توسیعی ڈیٹا، شکل 8)، دوسرے شکاریوں کی طرح جو خاص طور پر میٹابولائٹس تیار کرتے ہیں جیسے کہ Myxococcus41۔Ca کی دریافتEudormicrobiaceae کم دستیاب (گہرے سمندر میں) یا پروکاریوٹک نمونوں کے بجائے یوکرائیوٹک اس بات کی وضاحت کر سکتے ہیں کہ قدرتی خوراک کی تحقیق کے تناظر میں یہ بیکٹیریا اور ان کا غیر متوقع BGC تنوع کیوں غیر واضح رہتا ہے۔
بالآخر، ہم نے تجرباتی طور پر نئے راستے، خامروں اور قدرتی مصنوعات کی دریافت میں اپنے مائیکرو بایوم پر مبنی کام کے وعدے کی توثیق کرنے کی کوشش کی۔BGCs کی مختلف کلاسوں میں سے، RiPP پاتھ وے ایک بھرپور کیمیائی اور فنکشنل تنوع کو انکوڈ کرنے کے لیے جانا جاتا ہے جس کی وجہ بالغ انزائمز42 کے ذریعے کور پیپٹائڈ کی متعدد پوسٹ ٹرانسلیشنل ترمیمات ہیں۔تو ہم نے دو 'Ca کا انتخاب کیا۔Eudoremicrobium' RiPP BGCs (اعداد و شمار 3b اور 4a-e) کسی بھی معروف BGC (\(\bar{d}\)MIBiG اور \(\bar{d}\)0.2 سے اوپر RefSeq) پر مبنی ہیں۔
a–c، ان وٹرو ہیٹرولوگس ایکسپریشن اور ایک ناول (\(\bar{d}\)RefSeq = 0.29) گہرے سمندر میں Ca پرجاتیوں کے لیے مخصوص RiPP بائیو سنتھیسز کے کلسٹر کے وٹرو انزیمیٹک اسیسز۔E. malaspinii' diphosphoryated مصنوعات کی پیداوار کا باعث بنی۔c، ہائی ریزولوشن (HR) MS/MS (کیمیائی ڈھانچے میں b اور y آئنوں کے ذریعہ اشارہ کردہ ٹکڑے) اور NMR (توسیع شدہ ڈیٹا، تصویر 9) کا استعمال کرتے ہوئے شناخت کی گئی ترمیم۔d، یہ فاسفوریلیٹڈ پیپٹائڈ ممالیہ نیوٹروفیل ایلسٹیس کی کم مائکرومولر روک تھام کو ظاہر کرتا ہے، جو کنٹرول پیپٹائڈ اور ڈی ہائیڈریٹنگ پیپٹائڈ (کیمیائی ہٹانے کی وجہ سے پانی کی کمی) میں نہیں پایا جاتا ہے۔اسی طرح کے نتائج کے ساتھ تجربہ تین بار دہرایا گیا۔مثال کے طور پر، دوسرے ناول \(\bar{d}\)RefSeq = 0.33) پروٹین بائیو سنتھیسس کے کلسٹر کا متفاوت اظہار چار بالغ انزائمز کے کام کو واضح کرتا ہے جو 46 امینو ایسڈ کور پیپٹائڈ کو تبدیل کرتے ہیں۔باقیات HR-MS/MS، آاسوٹوپ لیبلنگ، اور NMR تجزیہ (اضافی معلومات) کے ذریعہ پیش گوئی کی گئی ترمیم کی سائٹ کے مطابق داغدار ہیں۔ڈیشڈ رنگین اشارہ کرتا ہے کہ ترمیم دونوں باقیات میں سے کسی ایک پر ہوتی ہے۔اعداد و شمار ایک ہی نیوکلئس پر تمام بالغ خامروں کی سرگرمی کو ظاہر کرنے کے لیے متعدد ہیٹرولوجس ساختوں کا مجموعہ ہے۔h، بیک بون امائیڈ N-methylation کے لیے NMR ڈیٹا کی مثال۔مکمل نتائج انجیر میں دکھائے گئے ہیں۔10 توسیعی ڈیٹا کے ساتھ۔i، MIBiG 2.0 ڈیٹا بیس میں پائے جانے والے تمام FkbM ڈومینز کے درمیان بالغ FkbM پروٹین کلسٹر انزائم کی فائیلوجنیٹک پوزیشن N-methyltransferase سرگرمی (اضافی معلومات) کے ساتھ اس خاندان کے ایک انزائم کو ظاہر کرتی ہے۔BGCs (a, e)، پیشگی پیپٹائڈ ڈھانچے (b، f)، اور قدرتی مصنوعات (c، g) کے پوٹیٹو کیمیائی ڈھانچے کے اسکیمیٹک خاکے دکھائے گئے ہیں۔
پہلا RiPP پاتھ وے (\(\bar{d}\)MIBiG = 0.41, \(\bar{d}\)RefSeq = 0.29) صرف گہرے سمندر کی انواع "Ca.E. malaspinii" اور کوڈز برائے پیپٹائڈ پرکرسر (تصویر 4a، b)۔اس بالغ انزائم میں، ہم نے ایک واحد فنکشنل ڈومین کی شناخت کی ہے جو لینٹی پیپٹائڈ سنتھیس کے ڈی ہائیڈریشن ڈومین سے ہم آہنگ ہے جو عام طور پر فاسفوریلیشن اور اس کے نتیجے میں 43 (اضافی معلومات) کو ہٹانے کو متحرک کرتا ہے۔لہذا، ہم پیش گوئی کرتے ہیں کہ پیشگی پیپٹائڈ کی ترمیم میں اس طرح کی دو قدمی پانی کی کمی شامل ہے۔تاہم، ٹینڈم ماس سپیکٹرو میٹری (MS/MS) اور نیوکلیئر میگنیٹک ریزوننس سپیکٹروسکوپی (NMR) کا استعمال کرتے ہوئے، ہم نے پولی فاسفوریلیٹڈ لکیری پیپٹائڈ (تصویر 4c) کی نشاندہی کی۔اگرچہ غیر متوقع طور پر، ہمیں اس کے حتمی مصنوعہ ہونے کی حمایت کرنے کے لیے ثبوت کی کئی سطریں ملیں: دو مختلف ہیٹرولوگس ہوسٹس اور وٹرو اسسیس میں پانی کی کمی نہیں، بالغ انزائم کی کیٹلیٹک ڈی ہائیڈریشن سائٹ میں تبدیل شدہ کلیدی اوشیشوں کی شناخت۔تمام "Ca" کے ذریعہ دوبارہ تعمیر کیا گیا ہے۔E. malaspinii جینوم (توسیع شدہ ڈیٹا، تصویر 9 اور اضافی معلومات) اور آخر کار، فاسفوریلیٹڈ پروڈکٹ کی حیاتیاتی سرگرمی، لیکن کیمیائی طور پر ترکیب شدہ پانی کی کمی والی شکل نہیں (تصویر 4d)۔درحقیقت، ہم نے پایا کہ یہ نیوٹروفیل ایلسٹیز کے خلاف ایک کم مائیکرومولر پروٹیز روکنے والی سرگرمی کو ظاہر کرتا ہے، جو کہ ارتکاز کی حد (IC50 = 14.3 μM) 44 میں دیگر متعلقہ قدرتی مصنوعات سے موازنہ کرتا ہے، اس حقیقت کے باوجود کہ ماحولیاتی کردار کو واضح کرنا باقی ہے۔ان نتائج کی بنیاد پر، ہم راستے کا نام "فاسفیپٹن" رکھنے کی تجویز دیتے ہیں۔
دوسرا کیس ایک پیچیدہ RiPP راستہ ہے جو 'Ca کے لیے مخصوص ہے۔جینس Eudoremicrobium (\(\bar{d}\)MIBiG = 0.46, \(\bar{d}\)RefSeq = 0.33) قدرتی پروٹین کی مصنوعات کو انکوڈ کرنے کی پیش گوئی کی گئی تھی (تصویر 4e)۔نسبتاً مختصر BGCs45 کے ذریعے انکوڈ شدہ انزائمز کے ذریعہ قائم کردہ متوقع کثافت اور مختلف قسم کی غیر معمولی کیمیائی تبدیلیوں کی وجہ سے یہ راستے خاص طور پر بائیوٹیکنالوجیکل دلچسپی کے حامل ہیں۔ہم نے پایا کہ یہ پروٹین پہلے کی خصوصیات والے پروٹینوں سے مختلف ہے کیونکہ اس میں پولی سیرامائڈز کے مرکزی NX5N شکل اور لینڈورنامائڈز 46 کے لینتھیونین لوپ دونوں کی کمی ہے۔عام ہیٹرولوگس اظہار کے نمونوں کی حدود پر قابو پانے کے لیے، ہم نے انہیں ایک کسٹم مائیکرو ویرگولا ایروڈینیٹریفکنس سسٹم کے ساتھ استعمال کیا تاکہ چار بالغ پاتھ وے انزائمز (طریقوں) کی خصوصیت کی جاسکے۔MS/MS، آاسوٹوپ لیبلنگ، اور NMR کے امتزاج کا استعمال کرتے ہوئے، ہم نے پیپٹائڈ کے 46-امینو ایسڈ کور میں ان بالغ خامروں کا پتہ لگایا (تصویر 4f،g، توسیع شدہ ڈیٹا، انجیر 10-12 اور اضافی معلومات)۔بالغ انزائمز میں، ہم نے RiPP پاتھ وے میں FkbM O-methyltransferase فیملی ممبر 47 کی پہلی ظاہری شکل کو نمایاں کیا اور غیر متوقع طور پر پایا کہ یہ بالغ انزائم بیک بون N-methylation (تصویر 4h، i اور اضافی معلومات) کو متعارف کراتا ہے۔اگرچہ یہ ترمیم قدرتی NRP48 مصنوعات میں جانا جاتا ہے، امائڈ بانڈز کا انزیمیٹک N-methylation ایک پیچیدہ لیکن بایوٹیکنالوجیکل طور پر اہم رد عمل49 ہے جو اب تک بوروسینز کے RiPP خاندان کے لیے دلچسپی کا باعث رہا ہے۔خصوصیت 50,51۔انزائمز اور آر آئی پی پی کے دوسرے خاندانوں میں اس سرگرمی کی شناخت نئی ایپلی کیشنز کو کھول سکتی ہے اور پروٹین 52 کے فعال تنوع اور ان کے کیمیائی تنوع کو بڑھا سکتی ہے۔شناخت شدہ ترمیمات اور مجوزہ مصنوعات کے ڈھانچے کی غیر معمولی لمبائی کی بنیاد پر، ہم ایک راستے کا نام "pythonamide" تجویز کرتے ہیں۔
انزائمز کے ایک فعال طور پر خصوصیات والے خاندان میں ایک غیر متوقع انزائمولوجی کی دریافت نئی دریافتوں کے لیے ماحولیاتی جینومکس کے وعدے کو واضح کرتی ہے، اور صرف ترتیب ہومولوجی کی بنیاد پر فنکشنل انفرنس کے لیے محدود صلاحیت کو بھی واضح کرتی ہے۔اس طرح، غیر کینونیکل بائیو ایکٹیو پولی فاسفوریلیٹڈ RiPPs کی رپورٹس کے ساتھ، ہمارے نتائج مصنوعی حیاتیات کی کوششوں کے لیے وسائل سے بھرپور لیکن اہم قدر کا مظاہرہ کرتے ہیں تاکہ حیاتیاتی کیمیکل مرکبات کی فنکشنل فراوانی، تنوع، اور غیر معمولی ڈھانچے کو مکمل طور پر ننگا کیا جا سکے۔
یہاں ہم عالمی سمندری مائکرو بایوم میں جرثوموں اور ان کے جینومک سیاق و سباق کے ذریعے انکوڈ کردہ بائیو سنتھیٹک صلاحیت کی حد کا مظاہرہ کرتے ہیں، جس کے نتیجے میں آنے والے وسائل کو سائنسی کمیونٹی (https://microbiomics.io/ocean/) کے لیے دستیاب کر کے مستقبل کی تحقیق میں سہولت فراہم کی جاتی ہے۔ہم نے پایا کہ اس کی زیادہ تر فائیلوجنیٹک اور فنکشنل نیاپن صرف MAGs اور SAGs کی تشکیل نو کے ذریعے حاصل کی جاسکتی ہے، خاص طور پر کم استعمال شدہ مائکروبیل کمیونٹیز میں جو مستقبل کی بائیو پراسپیکٹنگ کی کوششوں کی رہنمائی کرسکتی ہیں۔اگرچہ ہم یہاں 'Ca' پر توجہ مرکوز کریں گے۔Eudormicrobiaceae" بطور نسب خاص طور پر حیاتیاتی طور پر "باصلاحیت"، بہت سے BGCs جن کی پیش گوئی غیر دریافت شدہ مائیکرو بائیوٹا میں کی گئی ہے ممکنہ طور پر پہلے سے بیان نہ کیے گئے انزائمولوجیز کو انکوڈ کرتے ہیں جو ماحولیاتی اور/یا حیاتیاتی ٹیکنالوجی کے لحاظ سے اہم اعمال کے ساتھ مرکبات حاصل کرتے ہیں۔
سمندری طاسوں، گہری تہوں اور وقت کے ساتھ ساتھ عالمی سمندری مائکروبیل کمیونٹیز کی کوریج کو زیادہ سے زیادہ کرنے کے لیے کافی ترتیب کی گہرائی کے ساتھ بڑے سمندری اور ٹائم سیریز کے مطالعے سے میٹجینومک ڈیٹا سیٹس شامل کیے گئے تھے۔ان ڈیٹاسیٹس (ضمنی جدول 1 اور شکل 1) میں تارا کے سمندروں میں جمع کیے گئے نمونوں سے میٹاجینومکس شامل ہیں (وائرل افزودہ، n = 190؛ پروکریوٹک افزودہ، n = 180) 12,22 اور BioGEOTRACES مہم (n = 480)۔ہوائی اوشینک ٹائم سیریز (HOT, n = 68)، برمودا-اٹلانٹک ٹائم سیریز (BATS, n = 62)21 اور مالاسپینا مہم (n = 58)23۔BBMap (v.38.71) کا استعمال کرتے ہوئے کوالٹی کے لیے تمام میٹاجینومک ٹکڑوں کی ترتیب کے ریڈز کو ریڈز سے سیکوینسنگ اڈیپٹرز کو ہٹا کر، کوالٹی کنٹرول سیکوینسز (PhiX جینومز) میں میپ کیے گئے ریڈز کو ہٹا کر، اور trimq=14، maq=20 کا استعمال کرتے ہوئے پڑھے جانے والے کوالٹی کو خارج کر دیا گیا تھا۔ maxns = 0 اور minlength = 45۔ بعد کے تجزیے چلائے گئے یا QC ریڈز کے ساتھ ضم کیے گئے اگر وضاحت کی گئی ہو (bbmerge.sh minoverlap=16)۔میٹا اسپیڈس (v.3.11.1 یا v.3.12 اگر ضرورت ہو) کا استعمال کرتے ہوئے تعمیر کرنے سے پہلے QC ریڈنگ کو معمول بنایا گیا تھا (bbnorm.sh ہدف = 40، ذہن کی گہرائی = 0) 53۔نتیجے میں اسکافولڈ کونٹیگس (اس کے بعد اسکافولڈز کے نام سے جانا جاتا ہے) کو آخر کار لمبائی (≥1 kb) کے حساب سے فلٹر کیا گیا۔
1038 میٹاجینومک نمونوں کو گروپوں میں تقسیم کیا گیا تھا، اور نمونوں کے ہر گروپ کے لیے، تمام نمونوں کے میٹاجینومک کوالٹی کنٹرول ریڈز کو ہر نمونے کے بریکٹ سے الگ الگ ملایا گیا تھا، جس کے نتیجے میں جوڑے کے لحاظ سے بریکٹ والے گروپ کی درج ذیل تعداد ہوتی ہے: تارا میرین وائرسز - افزودہ (190×190)، پروکاریوٹس اینرچڈ (180×180)، بائیو جیوٹریس، ہاٹ اور بیٹس (610×610) اور مالاسپینا (58×58)۔نقشہ سازی Burrows-Wheeler-Aligner (BWA) (v.0.7.17-r1188)54 کا استعمال کرتے ہوئے کی گئی تھی جس کی مدد سے ریڈنگز کو ثانوی سائٹوں سے ملایا جا سکتا ہے (-a پرچم کا استعمال کرتے ہوئے)۔سیدھ میں کم از کم 45 بیسز لمبے ہونے کے لیے فلٹر کیے گئے تھے، ان کی ≥97% شناخت ہے، اور اسپین ≥80% پڑھا جاتا ہے۔نتیجے میں آنے والی BAM فائلوں کو jgi_summarize_bam_contig_depths اسکرپٹ کا استعمال کرتے ہوئے MetaBAT2 (v.2.12.1)55 کے لیے ہر گروپ کے لیے انٹرا اور انٹر-سیمپل کوریج فراہم کرنے کے لیے کارروائی کی گئی۔آخر میں، -minContig 2000 اور -maxEdges 500 کے ساتھ تمام نمونوں پر انفرادی طور پر MetaBAT2 چلا کر حساسیت کو بڑھانے کے لیے بریکٹس کو گروپ کیا گیا۔ ہم میٹا بی اے ٹی 2 کو ایک جوڑا باکسر کے بجائے استعمال کرتے ہیں کیونکہ اسے آزاد ٹیسٹوں میں سب سے زیادہ موثر واحد باکسر کے طور پر دکھایا گیا ہے۔اور عام طور پر استعمال ہونے والے دوسرے باکسرز سے 10 سے 50 گنا تیز۔کثرت کے ارتباط کے اثر کو جانچنے کے لیے، میٹاجینومکس کا تصادفی طور پر منتخب کردہ ذیلی نمونہ (Tara Ocean کے دو ڈیٹاسیٹس میں سے ہر ایک کے لیے 10، BioGEOTRACES کے لیے 10، ہر بار سیریز کے لیے 5، اور مالاسپینا کے لیے 5) اضافی طور پر صرف نمونے استعمال کیے گئے۔کوریج کی معلومات حاصل کرنے کے لیے اندرونی نمونوں کو گروپ کیا جاتا ہے۔(اضافی معلومات).
اضافی (بیرونی) جینوم بعد کے تجزیے میں شامل کیے گئے تھے، یعنی تارا اوشینز 26 ڈیٹاسیٹ کے ذیلی سیٹ سے 830 دستی طور پر منتخب کردہ MAGs، GORG20 ڈیٹاسیٹ سے 5287 SAGs، اور MAR ڈیٹا بیس (MarDB v. 4) سے ڈیٹا 1707 REFsol اور ہے۔ 682 SAGs) 27. MarDB ڈیٹاسیٹ کے لیے، جینوم کا انتخاب دستیاب میٹا ڈیٹا کی بنیاد پر کیا جاتا ہے اگر نمونے کی قسم درج ذیل ریگولر ایکسپریشن سے میل کھاتی ہے: '[S|s]ingle.?[C|c]ell|[C|c]ulture| [I|i] الگ تھلگ۔
چیک ایم (v.1.0.13) اور Anvi'o's Lineage Workflow (v.5.5.0)58,59 کا استعمال کرتے ہوئے ہر میٹاجینومک کنٹینر اور بیرونی جینوم کے معیار کا اندازہ لگایا گیا۔اگر CheckM یا Anvi'o ≥50% مکملیت/مکملیت اور ≤10% آلودگی/فالتو پن کی اطلاع دیتا ہے، تو بعد کے تجزیے کے لیے میٹجینومک خلیات اور بیرونی جینوم کو محفوظ کریں۔اس کے بعد ان اسکورز کو کمیونٹی کے معیار 60 کے مطابق جینوم کے معیار کی درجہ بندی کرنے کے لیے اوسط مکمل (mcpl) اور مطلب آلودگی (mctn) میں ملایا گیا: اعلی معیار: mcpl ≥ 90% اور mctn ≤ 5%؛اچھی کوالٹی: mcpl ≥ 70%، mctn ≤ 10%، درمیانہ معیار: mcpl ≥ 50% اور mctn ≤ 10%، منصفانہ معیار: mcpl ≤ 90% یا mctn ≥ 10%۔اس کے بعد فلٹر شدہ جینوم کو کوالٹی اسکورز (Q اور Q') کے ساتھ اس طرح منسلک کیا گیا: Q = mcpl – 5 x mctn Q' = mcpl – 5 x mctn + mctn x (تناؤ تغیر)/100 + 0.5 x log[N50]۔(dRep61 میں نافذ)۔
مختلف ڈیٹا ذرائع اور جینوم کی اقسام (MAG، SAG اور REF) کے درمیان تقابلی تجزیہ کی اجازت دینے کے لیے، dRep (v.2.5.4) کا استعمال کرتے ہوئے 34,799 جینومز کو جینوم وائیڈ اوسط نیوکلیوٹائڈ شناخت (ANI) کی بنیاد پر ڈیریفرنس کیا گیا۔دہرایا جاتا ہے۔اوپر بیان کردہ زیادہ سے زیادہ کوالٹی سکور (Q') کے مطابق ہر dRep کلسٹر کے لیے ایک نمائندہ جینوم منتخب کیا گیا تھا، جسے پرجاتیوں کا نمائندہ سمجھا جاتا تھا۔
نقشہ سازی کی رفتار کا اندازہ کرنے کے لیے، BWA (v.0.7.17-r1188, -a) کو OMD میں موجود 34,799 جینوم کے ساتھ میٹجینومک ریڈز کے تمام 1038 سیٹوں کا نقشہ بنانے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔کوالٹی کنٹرول ریڈز کو سنگل اینڈڈ موڈ میں میپ کیا گیا تھا اور اس کے نتیجے میں الائنمنٹس کو صرف سیدھ ≥45 bp لمبائی کو برقرار رکھنے کے لیے فلٹر کیا گیا تھا۔اور شناخت ≥95%۔ہر نمونے کے لیے ڈسپلے کا تناسب فلٹریشن کے بعد باقی رہ جانے والی ریڈنگز کا فیصد ہے جو کوالٹی کنٹرول ریڈنگز کی کل تعداد سے تقسیم کیا جاتا ہے۔اسی نقطہ نظر کو استعمال کرتے ہوئے، 1038 میٹاجینوم میں سے ہر ایک کو 5 ملین داخلوں (توسیع شدہ ڈیٹا، تصویر 1c) تک کم کر دیا گیا اور OMD اور تمام GEM16 میں GORG SAG سے ملایا گیا۔GEM16 کیٹلاگ میں سمندری پانی سے برآمد MAGs کی مقدار کا تعین میٹاجینومک ذرائع کے کلیدی الفاظ کے سوالات کے ذریعے کیا گیا، سمندری پانی کے نمونوں کا انتخاب (مثلاً، سمندری تلچھٹ کے برعکس)۔خاص طور پر، ہم "آبی" کو "ecosystem_category" کے طور پر، "marine" کو "ecosystem_type" کے طور پر منتخب کرتے ہیں، اور "Habitat" کو "گہرے سمندر"، "سمندری"، "بحری سمندری"، "پیلاجک میرین"، "میرین واٹر" کے طور پر فلٹر کرتے ہیں۔ "سمندر"، "سمندر کا پانی"، "سطح سمندر کا پانی"، "سطح سمندر کا پانی"۔اس کے نتیجے میں 5903 MAGs (734 اعلی کوالٹی) 1823 OTUs پر تقسیم ہوئے (یہاں آراء)۔
GTDB r89 ورژن 13 کو ہدف بنانے والے پہلے سے طے شدہ پیرامیٹرز کے ساتھ GTDB-Tk (v.1.0.2)64 کا استعمال کرتے ہوئے پروکریوٹک جینومز کو ٹیکسنومک طور پر تشریح کیا گیا تھا۔ Anvi'o کو ڈومین کی پیشن گوئی کی بنیاد پر یوکریوٹک جینوم کی شناخت کرنے اور ≥50% اور redundancy %10 کو یاد کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ایک پرجاتی کی درجہ بندی کی تشریح اس کے نمائندہ جینوم میں سے ایک کے طور پر بیان کی گئی ہے۔eukaryotes (148 MAG) کی رعایت کے ساتھ، ہر ایک جینوم کو پہلے فعال طور پر پروکا (v.1.14.5)65 کا استعمال کرتے ہوئے تشریح کی گئی تھی، مکمل جینوں کا نام دیا گیا تھا، ضرورت کے مطابق "آرچیا" یا "بیکٹیریا" کے پیرامیٹرز کی وضاحت کی گئی تھی، جو کہ غیر کے لیے بھی رپورٹ کی جاتی ہے۔ کوڈنگ جین.اور CRISPR کے علاقے، دیگر جینومک خصوصیات کے ساتھ۔fetchMG (v.1.2)66 کا استعمال کرتے ہوئے عالمگیر سنگل کاپی مارکر جینز (uscMG) کی شناخت کرکے پیشن گوئی شدہ جینوں کی تشریح کریں، ایگ این او جی (v.5.0)68 کی بنیاد پر ایمپر (v.2.0.1)67 کا استعمال کرتے ہوئے آرتھولوج گروپس اور استفسار کریں۔KEGG ڈیٹا بیس (شائع شدہ فروری 10، 2020) 69. آخری مرحلہ DIAMOND (v.0.9.30)70 کا استعمال کرتے ہوئے KEGG ڈیٹا بیس سے پروٹین کو ملا کر ≥70% کے سوال اور موضوع کی کوریج کے ذریعے انجام دیا گیا۔نتائج کو مزید فلٹر کیا گیا NCBI پروکاریوٹک جینوم اینوٹیشن پائپ لائن 71 کے مطابق زیادہ سے زیادہ متوقع بٹریٹ کے 50% بٹریٹ کی بنیاد پر (بذات خود لنک)۔پہلے سے طے شدہ پیرامیٹرز اور مختلف کلسٹر دھماکوں کے ساتھ antiSMASH (v.5.1.0)72 کا استعمال کرتے ہوئے جینوم میں BGCs کی شناخت کے لیے جین کی ترتیب کو بھی ان پٹ کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ویب پر دستیاب سیاق و سباق کے میٹا ڈیٹا کے ساتھ تمام جینومز اور تشریحات کو OMD میں مرتب کیا گیا ہے (https://microbiomics.io/ocean/)۔
پہلے بیان کردہ طریقوں کی طرح 12,22 ہم نے CD-HIT (v.4.8.1) استعمال کیا تاکہ OMD سے بیکٹیریل اور آرکیئل جینوم سے 56.6 ملین پروٹین کوڈنگ جینز کو 95% شناخت اور چھوٹے جینز (90% کوریج) 73 تک >17.7 ملین جین کلسٹرز۔سب سے طویل ترتیب کو ہر جین کلسٹر کے نمائندہ جین کے طور پر منتخب کیا گیا تھا۔اس کے بعد 1038 میٹاجینوم کو> 17.7 ملین BWA (-a) کلسٹر ممبروں سے ملایا گیا اور نتیجے میں BAM فائلوں کو صرف ≥95% فیصد شناخت اور ≥45 بیس سیدھ کے ساتھ سیدھ میں رکھنے کے لیے فلٹر کیا گیا۔لمبائی کے لحاظ سے نارملائزڈ جین کی کثرت کا حساب سب سے پہلے بہترین منفرد سیدھ سے داخلوں کی گنتی کے ذریعے کیا گیا تھا اور پھر، فجی میپڈ انسرٹس کے لیے، ان کے انوکھے داخلوں کی تعداد کے متناسب ٹارگٹ جینز میں فرکشنل گنتی شامل کر کے۔
توسیع شدہ OMD کے جینوم ("Ca. Eudormicrobiaceae" سے اضافی MAGs کے ساتھ، ذیل میں ملاحظہ کریں) MOTUs74 میٹاجینومک تجزیہ ٹول ڈیٹا بیس (v.2.5.1) میں ایک توسیع شدہ MOTU حوالہ ڈیٹا بیس بنانے کے لیے شامل کیے گئے تھے۔دس یو ایس سی ایم جی میں سے صرف چھ سنگل کاپی جینوم (23,528 جینوم) زندہ رہے۔ڈیٹا بیس کی توسیع کے نتیجے میں پرجاتیوں کی سطح پر 4,494 اضافی کلسٹرز پیدا ہوئے۔ڈیفالٹ ایم او ٹی یو پیرامیٹرز (v.2) کا استعمال کرتے ہوئے 1038 میٹاجینوم کا تجزیہ کیا گیا۔644 ایم او ٹی یو کلسٹرز میں موجود کل 989 جینومز (95% REF، 5% SAG اور 99.9% MarDB سے تعلق رکھتے ہیں) کا MOTU پروفائل کے ذریعے پتہ نہیں چلا۔یہ MarDB جینومز کی سمندری تنہائی کے مختلف اضافی ذرائع کی عکاسی کرتا ہے (زیادہ تر ناقابل شناخت جینوم تلچھٹ، سمندری میزبانوں وغیرہ سے الگ تھلگ حیاتیات سے وابستہ ہیں)۔اس مطالعہ میں کھلے سمندر کے ماحول پر توجہ مرکوز کرنے کے لیے، ہم نے انہیں بہاو کے تجزیہ سے خارج کر دیا جب تک کہ ان کا پتہ نہ لگایا گیا ہو یا اس مطالعہ میں بنائے گئے توسیعی ایم او ٹی یو ڈیٹا بیس میں شامل نہ کیا گیا ہو۔
OMD میں MAG، SAG اور REF کے تمام BGCs (اوپر دیکھیں) کو BGCs کے ساتھ ملایا گیا تھا جس کی شناخت تمام میٹاجینومک اسکافولڈز (اینٹی ایس ایم ایس ایچ v.5.0، ڈیفالٹ پیرامیٹرز) اور BiG-SLICE (v.1.1) (PFAM ڈومین )75 کا استعمال کرتے ہوئے کی گئی تھی۔ان خصوصیات کی بنیاد پر، ہم نے BGCs کے درمیان تمام کوسائن فاصلوں کا حساب لگایا اور بالترتیب 0.2 اور 0.8 کی دوری کی حدوں کا استعمال کرتے ہوئے انہیں GCF اور GCC میں گروپ کیا۔یہ حدیں ان حدوں کی موافقت ہیں جو پہلے یوکلیڈین فاصلہ 75 کا استعمال کرتے ہوئے کوسائن فاصلے کے ساتھ استعمال کرتے تھے، جو اصل BiG-SLICE کلسٹرنگ حکمت عملی (اضافی معلومات) میں کچھ خامیوں کو دور کرتی ہے۔
اس کے بعد BGCs کو فلٹر کیا گیا تاکہ سکیفولڈز پر صرف ≥5 kb انکوڈ کیا جا سکے تاکہ ٹکڑے ٹکڑے ہونے کے خطرے کو کم کیا جا سکے جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے16 اور MarDB REFs اور SAGs کو خارج کرنے کے لیے جو 1038 میٹاجینوم میں نہیں پائے گئے (اوپر دیکھیں)۔اس کے نتیجے میں مجموعی طور پر 39,055 BGCs کو OMD جینوم کے ذریعے انکوڈ کیا گیا، جس میں اضافی 14,106 کی شناخت میٹاجینومک ٹکڑوں پر کی گئی (یعنی MAGs میں جوڑ کر نہیں)۔یہ "میٹاجینومک" BGCs کا استعمال سمندری مائکرو بایوم بائیو سنتھیس کی صلاحیت کے تناسب کا تخمینہ لگانے کے لیے کیا گیا تھا جو ڈیٹا بیس میں نہیں لیا گیا تھا (اضافی معلومات)۔ہر BGC کی خصوصیات پیش گوئی کرنے والی مصنوعات کی اقسام کے مطابق کی گئی تھیں جن کی وضاحت اینٹی SMASH یا BiG-SCAPE76 میں بیان کردہ موٹے پروڈکٹ کیٹیگریز کے ذریعے کی گئی تھی۔مقدار میں نمونے لینے کے تعصب کو روکنے کے لیے (GCC/GCF کی درجہ بندی اور فعال ساخت، GCF اور GCC کا ڈیٹا بیس کے حوالے سے فاصلہ، اور GCF کی میٹاجینومک کثرت)، ہر ایک پرجاتی کے لیے صرف سب سے طویل BGC فی GCF رکھ کر، 39,055 BGCs کو مزید بڑھایا گیا۔ مجموعی طور پر 17,689 BGC کے نتیجے میں۔
GCC اور GCF کے نئے پن کا اندازہ حساب شدہ ڈیٹا بیس (Big-FAM میں RefSeq ڈیٹا بیس) 29 اور تجرباتی طور پر تصدیق شدہ (MIBIG 2.0) 30 BGC کے درمیان فاصلے کی بنیاد پر کیا گیا۔17,689 نمائندہ BGCs میں سے ہر ایک کے لیے، ہم نے متعلقہ ڈیٹا بیس کے لیے سب سے چھوٹی کوزائن فاصلے کا انتخاب کیا۔یہ کم از کم فاصلے پھر اوسط (مطلب) جی سی ایف یا جی سی سی کے مطابق، جیسا کہ مناسب ہیں۔اگر ڈیٹا بیس کا فاصلہ 0.2 سے زیادہ ہو تو GCF کو نیا سمجھا جاتا ہے، جو (اوسط) GCF اور حوالہ کے درمیان ایک مثالی علیحدگی کے مساوی ہے۔GCC کے لیے، ہم 0.4 کا انتخاب کرتے ہیں، جو کہ GCF کی طرف سے متعین حد سے دوگنا ہے، لنکس کے ساتھ طویل مدتی تعلقات کو بند کرنے کے لیے۔
BGC کی میٹجینومک کثرت کا اندازہ اس کے بائیو سنتھیٹک جینز کی اوسط کثرت کے طور پر لگایا گیا تھا (جیسا کہ اینٹی SMASH کے ذریعے طے کیا جاتا ہے) جین کی سطح کے پروفائلز سے دستیاب ہے۔ہر GCF یا GCC کی میٹجینومک کثرت کو پھر نمائندہ BGCs (17,689 میں سے) کے حساب سے شمار کیا گیا۔ان کثرت کے نقشوں کو بعد میں سیلولر کمپوزیشن کے لیے فی نمونہ ایم او ٹی یو شمار کا استعمال کرتے ہوئے معمول بنایا گیا، جس میں ترتیب دینے کی کوششیں بھی شامل تھیں (توسیع شدہ ڈیٹا، تصویر 1 ڈی)۔جی سی ایف یا جی سی سی کے پھیلاؤ کو کثرت> 0 کے ساتھ نمونوں کی فیصد کے طور پر شمار کیا گیا تھا۔
نمونوں کے درمیان یوکلیڈین فاصلے کا حساب عام جی سی ایف پروفائل سے کیا گیا تھا۔ان فاصلوں کو UMAP77 کا استعمال کرتے ہوئے سائز میں کم کیا گیا تھا اور نتیجے میں ایمبیڈنگس کو HDBSCAN78 کا استعمال کرتے ہوئے غیر زیر نگرانی کثافت پر مبنی کلسٹرنگ کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔HDBSCAN کی طرف سے استعمال کردہ کلسٹر کے لیے پوائنٹس کی بہترین کم از کم تعداد (اور اس وجہ سے کلسٹرز کی تعداد) کا تعین کلسٹر ممبرشپ کے مجموعی امکان کو زیادہ سے زیادہ کر کے کیا جاتا ہے۔شناخت شدہ کلسٹرز (اور ان کلسٹرز کا ایک بے ترتیب متوازن ذیلی نمونہ جو کہ تغیرات کے متغیر ملٹی ویریٹیٹ تجزیہ (PERMANOVA) میں تعصب کا سبب بنتا ہے۔نمونوں کے اوسط جینوم سائز کا حساب ایم او ٹی یو کی نسبتا کثرت اور جینوم کے ممبروں کے تخمینہ شدہ جینوم سائز کی بنیاد پر کیا گیا تھا۔خاص طور پر، ہر ایم او ٹی یو کے اوسط جینوم سائز کا اندازہ اس کے اراکین کے جینوم سائز کی اوسط کے طور پر لگایا گیا تھا جو مکمل ہونے کے لیے درست کیا گیا تھا (فلٹرنگ کے بعد) ایم بی)۔سالمیت کے ساتھ درمیانے جینوم کے لیے ≥70%۔اس کے بعد ہر نمونے کے لئے اوسط جینوم سائز کا حساب کیا گیا تھا جس کا وزن نسبتا کثرت کے حساب سے ایم او ٹی یو جینوم سائز کے مجموعہ کے طور پر کیا گیا تھا۔
OMD میں جینوم انکوڈ شدہ BGCs کا ایک فلٹر کردہ سیٹ بیکٹیریل اور آرچیل GTDB درختوں میں دکھایا گیا ہے (≥5 kb فریم ورک میں، REF اور SAG MarDB کو چھوڑ کر جو 1038 میٹاجینوم میں نہیں ملے، اوپر دیکھیں) اور ان کی پیشن گوئی کی گئی مصنوعات کی کیٹیگریز phyenetic کی بنیاد پر جینوم کی پوزیشن (اوپر دیکھیں)۔ہم نے سب سے پہلے پرجاتیوں کے لحاظ سے ڈیٹا کو کم کیا، نمائندہ کے طور پر اس پرجاتیوں میں سب سے زیادہ BGCs کے ساتھ جینوم کا استعمال کرتے ہوئے.تصور کے لیے، نمائندوں کو مزید درختوں کے گروہوں میں تقسیم کیا گیا، اور ایک بار پھر، ہر خلیے والے کلیڈ کے لیے، بی جی سی کی سب سے بڑی تعداد پر مشتمل جینوم کو بطور نمائندہ منتخب کیا گیا۔BGC سے افزودہ پرجاتیوں (> 15 BGCs کے ساتھ کم از کم ایک جینوم) ان BGCs میں انکوڈ شدہ مصنوعات کی اقسام کے لیے شینن ڈائیورسٹی انڈیکس کا حساب لگا کر مزید تجزیہ کیا گیا۔اگر تمام پیش گوئی شدہ مصنوعات کی اقسام ایک جیسی ہیں تو، کیمیائی ہائبرڈ اور دیگر پیچیدہ BGCs (جیسا کہ اینٹی SMAH کی طرف سے پیش گوئی کی گئی ہے) کو ایک ہی مصنوعات کی قسم سے تعلق رکھنے والے تصور کیا جاتا ہے، چاہے ان کا کلسٹر میں ترتیب کچھ بھی ہو (مثلاً پروٹین-بیکٹیریاسن اور بیکٹیریوسن-پروٹیو پروٹین فیوژن۔ جسم).ہائبرڈ)۔
مالاسپینا نمونہ MP1648 سے بقیہ ڈی این اے (تخمینہ 6 این جی)، حیاتیاتی نمونہ SAMN05421555 سے مماثل ہے اور مختصر پڑھنے کے لیے Illumina SRR3962772 میٹاجینومک ریڈ سیٹ سے مماثل ہے، PacBio سیکوینسنگ پروٹوکول کے مطابق پروسیس کیا گیا ہے کٹ (100-980-000) اور SMRTbell ایکسپریس 2.0 ٹیمپلیٹ تیاری کٹ (100-938-900)۔مختصراً، بقیہ ڈی این اے کووریس (جی ٹیوب، 52104) کا استعمال کرتے ہوئے کاٹا، مرمت اور صاف کیا گیا (ProNex موتیوں کی مالا)۔پیوریفائیڈ ڈی این اے کو اس کے بعد لائبریری کی تیاری، ایمپلیفیکیشن، پیوریفیکیشن (ProNex موتیوں) اور سائز کے انتخاب (>6 kb، بلیو پیپن) سے پہلے پیوریفیکیشن سٹیپ (ProNex beads) اور سیکوئل II پلیٹ فارم پر ترتیب دیا جاتا ہے۔
پہلے دو ca کی تعمیر نو۔MAG Eremiobacterota کے لیے، ہم نے چھ اضافی ANIs>99% کی نشاندہی کی (یہ شکل 3 میں شامل ہیں)، جنہیں ابتدائی طور پر آلودگی کے اسکور کی بنیاد پر فلٹر کیا گیا تھا (بعد میں جین کی نقل کے طور پر شناخت کیا گیا، نیچے دیکھیں)۔ہمیں "Ca" لیبل والی ٹرے بھی ملی۔Eremiobacterota" مختلف مطالعات سے 23 اور ان کا استعمال ہمارے مطالعے سے آٹھ MAGs کے ساتھ 633 یوکرائیوٹک افزودہ (>0.8 µm) نمونوں سے میٹجینومک ریڈز کے حوالہ کے طور پر BWA (v.0.7.17) Ref -r1188، – ایک جھنڈا) کے لیے نیچے کے نمونوں کے لیے۔ نقشہ سازی (5 ملین پڑھیں)افزودگی سے متعلق مخصوص نقشوں کی بنیاد پر (95% الائنمنٹ شناخت اور 80% پڑھنے کی کوریج سے فلٹر کیا گیا)، 10 میٹاجینوم (متوقع کوریج ≥5×) کو اسمبلی کے لیے منتخب کیا گیا اور مواد کے ارتباط کے لیے اضافی 49 میٹاجینوم (متوقع کوریج ≥1×) کا انتخاب کیا گیا۔اوپر والے پیرامیٹرز کا استعمال کرتے ہوئے، ان نمونوں کو بائن کیا گیا تھا اور 10 اضافی 'Ca' شامل کیے گئے تھے۔MAG Eremiobacterota کو بحال کر دیا گیا ہے۔یہ 16 MAGs (ڈیٹا بیس میں پہلے سے موجود دو کو شمار نہیں کر رہے ہیں) توسیع شدہ OMD میں جینوم کی کل تعداد 34,815 تک لے آتے ہیں۔MAGs کو ان کی جینومک مماثلت اور GTDB میں پوزیشن کی بنیاد پر ٹیکسونمک رینک تفویض کیے جاتے ہیں۔18 MAGs کو ایک ہی خاندان کے اندر 5 پرجاتیوں (انٹراسپیفک ANI> 99%) اور 3 جینرا (انٹرا جینرک ANI 85% سے 94%) میں dRep کا استعمال کرتے ہوئے نقل کیا گیا تھا79۔پرجاتیوں کے نمائندوں کو دستی طور پر سالمیت، آلودگی، اور N50 کی بنیاد پر منتخب کیا گیا تھا۔ضمنی معلومات میں تجویز کردہ نام فراہم کیا گیا ہے۔
'Ca کی سالمیت اور آلودگی کا اندازہ لگائیں۔MAG Eremiobacterota، ہم نے uscMG کی موجودگی کا اندازہ لگایا، نیز نسب- اور ڈومین کے لیے مخصوص سنگل کاپی مارکر جین سیٹ جو CheckM اور Anvi'o کے ذریعے استعمال ہوتے ہیں۔40 uscMGs میں سے 2 ڈپلیکیٹس کی شناخت کی تصدیق فائیلوجنیٹک تعمیر نو (نیچے ملاحظہ کریں) کے ذریعے کی گئی تاکہ کسی بھی ممکنہ آلودگی کو مسترد کیا جا سکے (یہ ان 40 مارکر جینز کی بنیاد پر 5 فیصد کے مساوی ہے)۔پانچ نمائندہ MAGs 'Ca کا ایک اضافی مطالعہ۔ان تعمیر نو کے جینوم میں آلودگی کی کم سطح کی تصدیق Eremiobacterota پرجاتیوں کے لیے انٹرایکٹو Anvi'o انٹرفیس کا استعمال کرتے ہوئے کی گئی تھی جس کی بنیاد کثرت اور ترتیب کی ساخت کے ارتباط (ضمنی معلومات) 59 پر ہے۔
فائیلوجینومک تجزیہ کے لیے، ہم نے پانچ نمائندہ MAGs "Ca" کا انتخاب کیا۔Eudormicrobiaceae"، تمام پرجاتیوں "Ca.Eremiobacterota کا جینوم اور دیگر phyla کے ارکان (بشمول UBP13، Armatimonadota، Patescibacteria، Dormibacterota، Chloroflexota، Cyanobacteria، Actinobacteria اور Planctomycetota) GTDB (r89)13 سے دستیاب ہے۔ان تمام جینوموں کی تشریح کی گئی تھی جیسا کہ پہلے سنگل کاپی مارکر جین نکالنے اور بی جی سی تشریح کے لیے بیان کیا گیا تھا۔GTDB جینومز کو مندرجہ بالا سالمیت اور آلودگی کے معیار کے مطابق محفوظ کیا گیا تھا۔Phylogenetic تجزیہ Anvi'o Phylogenetics59 ورک فلو کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔درخت کو IQTREE (v.2.0.3) (پہلے سے طے شدہ اختیارات اور -bb 1000)80 کا استعمال کرتے ہوئے 39 ٹینڈم رائبوسومل پروٹینوں کی سیدھ پر بنایا گیا تھا جس کی شناخت Anvi'o (MUSCLE, v.3.8.1551)81 نے کی تھی۔اس کے عہدے کم کر دیے گئے۔جینوم 82 کے کم از کم 50٪ کا احاطہ کرنے کے لئے اور پلانکٹومیسیکوٹا کو GTDB ٹری ٹوپولوجی کی بنیاد پر آؤٹ گروپ کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔40 uscMGs کا ایک درخت انہی ٹولز اور پیرامیٹرز کا استعمال کرتے ہوئے بنایا گیا تھا۔
ہم نے عام مائکروبیل خصلتوں کی پیشن گوئی کرنے کے لیے پہلے سے طے شدہ پیرامیٹرز (فینوٹائپ، نیوکلیوٹائڈز سے) 83 کے ساتھ Traitar (v.1.1.2) کا استعمال کیا۔ہم نے پہلے سے تیار کردہ شکاری انڈیکس 84 پر مبنی ایک ممکنہ شکاری طرز زندگی کی کھوج کی جو جینوم میں پروٹین کوڈنگ جین کے مواد پر منحصر ہے۔خاص طور پر، ہم آرتھو ایم سی ایل ڈیٹا بیس (v.4)85 کے مقابلے جینوم میں پروٹین کا موازنہ کرنے کے لیے ڈائمنڈ کا استعمال کرتے ہیں۔ شکاریوں اور غیر شکاریوں کے لیے مارکر جین۔انڈیکس شکاری اور غیر شکاری نشانات کی تعداد کے درمیان فرق ہے۔ایک اضافی کنٹرول کے طور پر، ہم نے "Ca" جینوم کا بھی تجزیہ کیا۔Entotheonella TSY118 عنصر Ca کے ساتھ اس کی وابستگی پر مبنی ہے۔Eudoremicrobium (بڑا جینوم سائز اور بایو سنتھیٹک صلاحیت)۔اگلا، ہم نے شکاری اور غیر شکاری مارکر جین اور Ca کی بایو سنتھیٹک صلاحیت کے درمیان ممکنہ روابط کا تجربہ کیا۔Eudormicrobiaceae" اور پایا کہ ایک سے زیادہ جین (کسی بھی قسم کے مارکر جین سے، یعنی شکاری/غیر شکاری جین سے) BGC کے ساتھ اوورلیپ نہیں ہوتے ہیں، یہ تجویز کرتے ہیں کہ BGC شکاری سگنلز کو الجھانے نہیں دیتا۔سکیمبلڈ ریپلکنز کی اضافی جینومک تشریح TXSSCAN (v.1.0.2) کا استعمال کرتے ہوئے خاص طور پر رطوبت کے نظام، پیلی، اور flagella86 کی جانچ کرنے کے لیے کی گئی۔
پانچ نمائندے 'Ca' کو تارا سمندروں کے 22,40,87 (BWA، v.0.7.17-r1188، -a پرچم کا استعمال کرتے ہوئے) کے پروکاریوٹک اور یوکرائیوٹک افزودگی کے حصوں سے 623 میٹا ٹرانسکرپٹومز کی نقشہ سازی کے ذریعے نقشہ بنایا گیا۔Eudormicrobiaceae جینوم۔BAM فائلوں کو فیچر کاؤنٹ (v.2.0.1)88 کے ساتھ 80% پڑھنے کی کوریج اور 95% شناختی فلٹرنگ کے ساتھ پروسیس کیا گیا تھا (اختیارات کے ساتھ فیچر کاؤنٹ -primary -O -fraction -t CDS,tRNA -F GTF -g ID -p) فی جین داخلوں کی تعداد۔تیار کردہ نقشوں کو جین کی لمبائی اور مارکر جین کی کثرت ایم او ٹی یو کے لیے معمول بنایا گیا تھا (لمبائی-نارملائزڈ اوسط اندراج کی گنتی کے ساتھ جین کے اندراج کی گنتی> 0) اور لاگ ان کو 22.74 میں تبدیل کر دیا گیا تاکہ ہر جین کی سطح کے فی سیل رشتہ دار اظہار حاصل کیا جا سکے۔ ترتیب کے دوران نمونے سے نمونے تک تغیر۔اس طرح کے تناسب تقابلی تجزیہ کی اجازت دیتے ہیں، نسبتا کثرت ڈیٹا کا استعمال کرتے وقت ساخت کے مسائل کو کم کرتے ہیں۔مزید تجزیہ کے لیے 10 ایم او ٹی یو مارکر جین میں سے صرف> 5 والے نمونوں پر غور کیا گیا تاکہ جینوم کے کافی بڑے حصے کا پتہ چل سکے۔
'Ca کا نارملائزڈ ٹرانسکرپٹوم پروفائل۔E. taraoceanii کو UMAP کا استعمال کرتے ہوئے جہتی کمی کا نشانہ بنایا گیا اور اس کے نتیجے میں اظہار کی حیثیت کا تعین کرنے کے لیے HDBSCAN (اوپر دیکھیں) کا استعمال کرتے ہوئے غیر زیر نگرانی کلسٹرنگ کے لیے استعمال کیا گیا۔PERMANOVA اصل (کم نہیں) فاصلے کی جگہ میں شناخت شدہ کلسٹرز کے درمیان فرق کی اہمیت کو جانچتا ہے۔ان حالات کے درمیان تفریق کا اظہار پورے جینوم میں کیا گیا (اوپر دیکھیں) اور 201 کے ای جی جی راستوں کی شناخت 6 فنکشنل گروپس میں کی گئی، یعنی: BGC، سراو کا نظام اور TXSSCAN سے فلیجیلر جین، انحطاط کے انزائمز (پروٹیز اور پیپٹائڈیسز)، اور شکاری اور غیر شکاری جین.شکاری انڈیکس مارکرہر نمونے کے لیے، ہم نے ہر طبقے کے لیے میڈین نارملائزڈ ایکسپریشن کا حساب لگایا (نوٹ کریں کہ BGC ایکسپریشن خود اس BGC کے لیے بائیو سنتھیٹک جینز کے میڈین ایکسپریشن کے طور پر شمار کیا جاتا ہے) اور تمام ریاستوں میں اہمیت کے لیے ٹیسٹ کیا گیا (FDR کے لیے کرسکل والس ٹیسٹ ایڈجسٹ کیا گیا)۔
مصنوعی جین جن اسکرپٹ سے خریدے گئے تھے اور پی سی آر پرائمر مائیکرو سنتھ سے خریدے گئے تھے۔تھرمو فشر سائنٹیفک سے فیوژن پولیمریز ڈی این اے پروردن کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔نیوکلیو اسپن پلاسمڈز، نیوکلیو اسپن جیل اور مچری-ناگل سے پی سی آر پیوریفیکیشن کٹ ڈی این اے پیوریفیکیشن کے لیے استعمال کی گئیں۔پابندی کے انزائمز اور T4 DNA ligase نیو انگلینڈ بائلابس سے خریدے گئے تھے۔isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) (Biosynth) اور 1,4-dithiothreitol (DTT، AppliChem) کے علاوہ دیگر کیمیکلز سگما-الڈرچ سے خریدے گئے تھے اور انہیں مزید صاف کیے بغیر استعمال کیا گیا تھا۔اینٹی بائیوٹکس کلورامفینیکول (سی ایم)، اسپیکٹینومائسن ڈائی ہائڈروکلورائڈ (ایس ایم)، ایمپیسلن (ایم پی)، جینٹامیسن (جی ٹی)، اور کاربینیسیلن (سی بی این) AppliChem سے خریدی گئیں۔Bacto Tryptone اور Bacto Yeast Extract میڈیا کے اجزاء BD بایو سائنسز سے خریدے گئے تھے۔ترتیب کے لیے ٹرپسن پرومیگا سے خریدی گئی تھی۔
جین کی ترتیب اینٹی SMASH پیش گوئی شدہ BGC 75.1 سے نکالی گئی تھی۔E. malaspinii (اضافی معلومات)۔
جین ایم اے (لوکس، MALA_SAMN05422137_METAG-framework_127-gene_5)، embM (locus، MALA_SAMN05422137_METAG-framework_127-gene_4)، اور embAM (بشمول انٹرجین ریجنز) بغیر مطابقت پذیری کے ساتھ مطابقت پذیر تھے s کو E میں اظہار کے لیے بہتر بنایا گیا ہے۔ کب.embA جین کو PACYCDuet-1 (CmR) اور pCDFDuet-1 (SmR) کی پہلی متعدد کلوننگ سائٹ (MCS1) میں BamHI اور HindIII کلیویج سائٹس کے ساتھ سبکلون کیا گیا تھا۔ایم ایم ایم اور ایم ایم موپٹ جین (کوڈن آپٹمائزڈ) کو MCS1 pCDFDuet-1 (SmR) میں BamHI اور HindIII کے ساتھ ذیلی کلون کیا گیا تھا اور pCDFDuet-1 (SmR) اور pRSFDuet-1 (KanR) (MCS2) کی دوسری متعدد کلوننگ سائٹ میں رکھا گیا تھا۔ NdeI/ChoI۔ایم ایم اے ایم کیسٹ کو پی سی ڈی ایف ڈیویٹ 1 (ایس ایم آر) میں بام ایچ آئی اور ہندIII کلیویج سائٹس کے ساتھ سبکلون کیا گیا تھا۔orf3/embI جین (لوکس، MALA_SAMN05422137_METAG-scaffold_127-gene_3) پرائمر EmbI_OE_F_NdeI اور EmbI_OE_R_XhoI کا استعمال کرتے ہوئے اوورلیپ ایکسٹینشن PCR کے ذریعے تعمیر کیا گیا تھا، جس کو NdeM-1-1-1/XHM/XHM//// ) ایک ہی پابندی والے خامروں کا استعمال کرتے ہوئے (اضافی ٹیبل).6)۔پابندی ینجائم عمل انہضام اور ligation کارخانہ دار کے پروٹوکول (نیو انگلینڈ بائلابس) کے مطابق انجام دیا گیا تھا۔