304 سٹینلیس سٹیل کوائل ٹیوبنگ کیمیکل جزو ,SPACA6 ایکٹوڈومین کی ساخت میں گیمیٹ فیوژن کے ساتھ منسلک پروٹینوں کی ایک محفوظ سطح پر مشتمل ہے۔

Nature.com پر جانے کا شکریہ۔آپ محدود سی ایس ایس سپورٹ کے ساتھ براؤزر کا ورژن استعمال کر رہے ہیں۔بہترین تجربے کے لیے، ہم تجویز کرتے ہیں کہ آپ ایک اپ ڈیٹ شدہ براؤزر استعمال کریں (یا انٹرنیٹ ایکسپلورر میں مطابقت موڈ کو غیر فعال کریں)۔اس کے علاوہ، جاری تعاون کو یقینی بنانے کے لیے، ہم سائٹ کو بغیر اسٹائل اور جاوا اسکرپٹ کے دکھاتے ہیں۔
سلائیڈرز فی سلائیڈ تین مضامین دکھا رہے ہیں۔سلائیڈوں کے ذریعے جانے کے لیے پیچھے اور اگلے بٹنوں کا استعمال کریں، یا ہر سلائیڈ سے گزرنے کے لیے آخر میں سلائیڈ کنٹرولر بٹن استعمال کریں۔

SPACA6 ایک سپرم سے ظاہر ہونے والا سطحی پروٹین ہے جو ممالیہ کی جنسی تولید کے دوران گیمیٹ فیوژن کے لیے اہم ہے۔اس بنیادی کردار کے باوجود، SPACA6 کے مخصوص فنکشن کو اچھی طرح سے سمجھا نہیں گیا ہے۔ہم 2.2 Å کی ریزولوشن پر SPACA6 کے ایکسٹرا سیلولر ڈومین کے کرسٹل ڈھانچے کو واضح کرتے ہیں، جس میں ایک دو ڈومین پروٹین کا انکشاف ہوتا ہے جس میں چار پھنسے ہوئے بنڈل اور Ig جیسے β-sandwiches کو ارد لچکدار لنکرز کے ذریعے شامل کیا جاتا ہے۔یہ ڈھانچہ IZUMO1 سے مشابہت رکھتا ہے، ایک اور گیمیٹ فیوژن سے وابستہ پروٹین، جو SPACA6 اور IZUMO1 کو فرٹلائزیشن سے وابستہ پروٹینوں کی انتہائی فیملی کے بانی ممبر بناتا ہے جسے یہاں IST سپر فیملی کہا جاتا ہے۔IST انتہائی خاندانی طور پر اس کے بٹے ہوئے چار ہیلکس بنڈل اور ڈسلفائیڈ سے منسلک CXXC شکلوں کے جوڑے کے ذریعہ ساختی طور پر بیان کیا گیا ہے۔انسانی پروٹوم کی ساخت پر مبنی الفا فولڈ تلاش نے اس انتہائی خاندان کے اضافی پروٹین ارکان کی نشاندہی کی۔خاص طور پر، ان میں سے بہت سے پروٹین گیمیٹ فیوژن میں شامل ہیں۔SPACA6 کا ڈھانچہ اور IST کے دیگر ممبران کے ساتھ اس کا رشتہ انتہائی خاندانی طور پر ممالیہ گیمیٹ فیوژن کے ہمارے علم میں گمشدہ ربط فراہم کرتا ہے۔
ہر انسان کی زندگی دو الگ الگ ہیپلوڈ گیمیٹس سے شروع ہوتی ہے: باپ کا نطفہ اور ماں کا انڈا۔یہ نطفہ انتخاب کے ایک شدید عمل کا فاتح ہے جس کے دوران لاکھوں سپرم سیلز زنانہ اعضاء کی نالی سے گزرتے ہیں، مختلف رکاوٹوں کو عبور کرتے ہیں اور کیپسیٹیشن سے گزرتے ہیں، جس سے ان کی حرکت پذیری اور سطحی اجزاء کے عمل میں اضافہ ہوتا ہے 2,3,4۔یہاں تک کہ اگر سپرم اور oocyte ایک دوسرے کو تلاش کرتے ہیں، تو یہ عمل ابھی ختم نہیں ہوا ہے۔oocyte cumulus خلیات کی ایک تہہ سے گھرا ہوا ہے اور ایک glycoprotein بیریئر جسے zona pellucida کہتے ہیں، جس کے ذریعے نطفہ کو oocyte میں داخل ہونے کے لیے گزرنا ضروری ہے۔سپرمیٹوزوا ان آخری رکاوٹوں پر قابو پانے کے لیے سطح کے آسنجن مالیکیولز اور جھلی سے وابستہ اور خفیہ انزائمز کا مجموعہ استعمال کرتا ہے۔یہ مالیکیولز اور انزائمز بنیادی طور پر اندرونی جھلی اور ایکروسومل میٹرکس میں محفوظ ہوتے ہیں اور ان کا پتہ اس وقت ہوتا ہے جب سپرم کی بیرونی جھلی کو اکروسومل ری ایکشن کے دوران لیس کیا جاتا ہے۔اس شدید سفر کا آخری مرحلہ سپرم-ایگ فیوژن ایونٹ ہے، جس میں دو خلیے اپنی جھلیوں کو فیوز کرتے ہیں تاکہ ایک واحد ڈپلائیڈ جاندار بن جائے۔اگرچہ یہ عمل انسانی تولید میں اہم ہے، لیکن ضروری سالماتی تعاملات کو اچھی طرح سے سمجھا نہیں جاتا ہے۔
گیمیٹس کی فرٹیلائزیشن کے علاوہ، دو لپڈ بیلیئرز کے فیوژن کی کیمسٹری کا بڑے پیمانے پر مطالعہ کیا گیا ہے۔عام طور پر، جھلی کا فیوژن ایک توانائی کے لحاظ سے ناموافق عمل ہے جس میں ساختی تبدیلی سے گزرنے کے لیے ایک پروٹین کیٹالسٹ کی ضرورت ہوتی ہے جو دو جھلیوں کو ایک دوسرے کے قریب لاتا ہے، ان کا تسلسل ٹوٹ جاتا ہے اور فیوژن 8,9 کا سبب بنتا ہے۔یہ پروٹین اتپریرک fusogens کے نام سے جانے جاتے ہیں اور ان گنت فیوژن سسٹمز میں پائے جاتے ہیں۔میزبان خلیوں میں وائرل داخلے کے لیے ان کی ضرورت ہے (مثال کے طور پر، HIV-1 میں gp160، کورونا وائرس میں اسپائک، انفلوئنزا وائرس میں ہیماگلوٹینن) 10,11,12 پلیسینٹل (syncytin) 13,14,15 اور نچلے یوکرائٹس میں گیمیٹ بنانے والے فیوژن ( پودوں، پروٹسٹ اور آرتھروپڈز میں HAP2/GCS1) 16,17,18,19۔انسانی گیمیٹس کے لیے فیوزوجینز ابھی تک دریافت نہیں ہوئے ہیں، حالانکہ کئی پروٹینوں کو گیمیٹ اٹیچمنٹ اور فیوژن کے لیے اہم دکھایا گیا ہے۔oocyte-expressed CD9، ایک ٹرانس میمبرن پروٹین جو ماؤس اور انسانی گیمیٹس کے فیوژن کے لیے ضروری ہے، 21,22,23 دریافت ہونے والا پہلا تھا۔اگرچہ اس کا قطعی فعل ابھی تک واضح نہیں ہے، لیکن آسنجن میں ایک کردار، انڈے کے مائکروویلی پر آسنجن فوکی کی ساخت، اور/یا oocyte سطح کے پروٹین کی درست لوکلائزیشن کا امکان 24,25,26 لگتا ہے۔دو سب سے عام پروٹین جو گیمیٹ فیوژن کے لیے اہم ہیں سپرم پروٹین IZUMO127 اور oocyte پروٹین JUNO28 ہیں، اور ان کا باہمی تعلق فیوژن سے پہلے گیمیٹ کی پہچان اور چپکنے کا ایک اہم مرحلہ ہے۔نر Izumo1 ناک آؤٹ چوہے اور مادہ جونو ناک آؤٹ چوہے مکمل طور پر جراثیم سے پاک ہوتے ہیں، ان ماڈلز میں سپرم پیرویٹیلائن کی جگہ میں داخل ہوتے ہیں لیکن گیمیٹس فیوز نہیں ہوتے۔اسی طرح، جب گیمیٹس کو اینٹی IZUMO1 یا JUNO27,29 اینٹی باڈیز کے ساتھ انسانی ان وٹرو فرٹیلائزیشن تجربات میں علاج کیا گیا تو سنگم کو کم کیا گیا۔
حال ہی میں، فینوٹائپ طور پر IZUMO1 اور JUNO20,30,31,32,33,34,35 سے ملتے جلتے سپرم سے اظہار شدہ پروٹین کا ایک نیا دریافت شدہ گروپ دریافت ہوا ہے۔سپرم ایکروسومل میمبرین سے وابستہ پروٹین 6 (SPACA6) کو بڑے پیمانے پر مورین میوٹیجینیسیس مطالعہ میں فرٹلائجیشن کے لیے ضروری کے طور پر شناخت کیا گیا ہے۔Spaca6 جین میں ٹرانسجن کے داخل ہونے سے نان فیوز ایبل سپرمیٹوزوا پیدا ہوتا ہے، حالانکہ یہ سپرمیٹوزوا پیرویٹیلائن اسپیس 36 میں گھس جاتے ہیں۔چوہوں کے بعد ناک آؤٹ اسٹڈیز نے اس بات کی تصدیق کی کہ گیمیٹ فیوژن 30,32 کے لیے Spaca6 کی ضرورت ہے۔SPACA6 کا اظہار تقریباً خصوصی طور پر خصیوں میں ہوتا ہے اور اس کا لوکلائزیشن پیٹرن IZUMO1 کی طرح ہوتا ہے، یعنی اکروسومل ری ایکشن سے پہلے سپرمیٹوزوا کے انٹیما کے اندر، اور پھر اکروسومل ری ایکشن 30,32 کے بعد استوائی خطے میں منتقل ہوتا ہے۔Spaca6 homologues مختلف قسم کے ستنداریوں اور دیگر eukaryotes 30 میں موجود ہیں اور انسانی گیمیٹ فیوژن کے لیے اس کی اہمیت کو SPACA6 30 کے خلاف مزاحمت کے ذریعے وٹرو میں انسانی فرٹیلائزیشن کی روک تھام سے ظاہر کیا گیا ہے۔IZUMO1 اور JUNO کے برعکس، SPACA6 کی ساخت، تعاملات اور کام کی تفصیلات غیر واضح ہیں۔
انسانی نطفہ اور انڈوں کے فیوژن کے بنیادی عمل کو بہتر طور پر سمجھنے کے لیے، جو ہمیں خاندانی منصوبہ بندی اور زرخیزی کے علاج میں مستقبل میں ہونے والی پیش رفت سے آگاہ کرنے کے قابل بنائے گا، ہم نے SPACA6 ساختی اور حیاتیاتی کیمیائی مطالعات کا انعقاد کیا۔SPACA6 کے ایکسٹرا سیلولر ڈومین کا کرسٹل ڈھانچہ ایک چار ہیلیکل بنڈل (4HB) اور ایک امیونوگلوبلین نما (Ig-like) ڈومین دکھاتا ہے جو نیم لچکدار خطوں سے جڑا ہوا ہے۔جیسا کہ پچھلے مطالعات میں پیش گوئی کی گئی ہے، 7,32,37 SPACA6 کا ڈومین ڈھانچہ انسانی IZUMO1 سے ملتا جلتا ہے، اور دونوں پروٹین ایک غیر معمولی شکل کا اشتراک کرتے ہیں: 4HB ایک مثلث ہیلیکل سطح کے ساتھ اور ڈسلفائیڈ سے منسلک CXXC شکلوں کا ایک جوڑا۔ہم تجویز کرتے ہیں کہ IZUMO1 اور SPACA6 اب گیمیٹ فیوژن سے وابستہ پروٹین کی ایک بڑی، ساختی طور پر متعلقہ سپر فیملی کی وضاحت کرتے ہیں۔سپر فیملی کے لیے منفرد خصوصیات کا استعمال کرتے ہوئے، ہم نے الفا فولڈ ساختی انسانی پروٹوم کے لیے ایک مکمل تلاش کی، جس میں اس سپر فیملی کے اضافی اراکین کی شناخت کی گئی، بشمول گیمیٹ فیوژن اور/یا فرٹیلائزیشن میں شامل متعدد اراکین۔اب یہ ظاہر ہوتا ہے کہ گیمیٹ فیوژن سے وابستہ پروٹینوں کا ایک مشترکہ ساختی تہہ اور انتہائی خاندان ہے، اور ہماری ساخت انسانی گیمیٹ فیوژن میکانزم کے اس اہم پہلو کا سالماتی نقشہ فراہم کرتی ہے۔
SPACA6 ایک واحد پاس ٹرانس میبرن پروٹین ہے جس میں ایک N-linked glycan اور چھ پوٹیٹیو ڈسلفائیڈ بانڈز (اعداد و شمار S1a اور S2) ہیں۔ہم نے ڈروسوفلا S2 خلیوں میں انسانی SPACA6 (اوشیشوں 27–246) کے ایکسٹرا سیلولر ڈومین کا اظہار کیا اور نکل وابستگی، کیشن ایکسچینج، اور سائز کے اخراج کرومیٹوگرافی (تصویر S1b) کا استعمال کرتے ہوئے پروٹین کو پاک کیا۔صاف شدہ SPACA6 ایکٹوڈومین بہت مستحکم اور یکساں ہے۔کثیرالاضلاع لائٹ سکیٹرنگ (SEC-MALS) کے ساتھ مل کر سائز کے اخراج کی کرومیٹوگرافی کا استعمال کرتے ہوئے تجزیہ نے 26.2 ± 0.5 kDa (تصویر S1c) کے حسابی مالیکیولر وزن کے ساتھ ایک چوٹی کا انکشاف کیا۔یہ SPACA6 monomeric ectodomain کے سائز کے مطابق ہے، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ oligomerization طہارت کے دوران نہیں ہوا تھا۔اس کے علاوہ، سرکلر ڈیکروزم (CD) سپیکٹروسکوپی نے 51.3 °C (تصویر S1d,e) کے پگھلنے والے نقطہ کے ساتھ ایک مخلوط α/β ساخت کا انکشاف کیا۔CD سپیکٹرا کے Deconvolution سے 38.6% α-helical اور 15.8% β-stranded عناصر (Figure S1d) کا انکشاف ہوا۔
SPACA6 ایکٹوڈومین کو بے ترتیب میٹرکس سیڈنگ38 کا استعمال کرتے ہوئے کرسٹلائز کیا گیا تھا جس کے نتیجے میں 2.2 Å (ٹیبل 1 اور فگر S3) کی ریزولوشن کے ساتھ ڈیٹا سیٹ ہوتا ہے۔ساخت کے تعین کے لیے برومائڈ کی نمائش کے ساتھ ٹکڑے پر مبنی مالیکیولر متبادل اور SAD فیزنگ ڈیٹا کے امتزاج کا استعمال کرتے ہوئے (ٹیبل 1 اور شکل S4)، حتمی بہتر ماڈل 27–246 باقیات پر مشتمل ہے۔جس وقت ساخت کا تعین کیا گیا تھا، وہاں کوئی تجرباتی یا الفا فولڈ ڈھانچے دستیاب نہیں تھے۔SPACA6 ایکٹوڈومین کی پیمائش 20 Å × 20 Å × 85 Å ہے، سات ہیلیکس اور نو β-سٹرینڈز پر مشتمل ہے، اور اس میں چھ ڈسلفائیڈ بانڈز (تصویر 1a، b) کے ذریعے مستحکم ترتیری تہہ ہے۔Asn243 سائڈ چین کے آخر میں الیکٹران کی کمزور کثافت اس بات کی نشاندہی کرتی ہے کہ یہ باقیات N سے منسلک گلائکوسیلیشن ہے۔ڈھانچہ دو ڈومینز پر مشتمل ہے: ایک N-ٹرمینل فور ہیلکس بنڈل (4HB) اور ایک C-ٹرمینل Ig جیسا ڈومین جس کے درمیان درمیانی قبضہ والا علاقہ ہے (تصویر 1c)۔
SPACA6 کے ایکسٹرا سیلولر ڈومین کا ڈھانچہ۔SPACA6 کے ایکسٹرا سیلولر ڈومین کی پٹی کا خاکہ، N سے C-ٹرمینس تک کی زنجیر کا رنگ گہرے نیلے سے گہرے سرخ تک۔ڈسلفائیڈ بانڈز میں شامل سسٹینز کو مینجٹا میں نمایاں کیا گیا ہے۔b SPACA6 کے ایکسٹرا سیلولر ڈومین کی ٹوپولوجی۔وہی رنگ سکیم استعمال کریں جیسا کہ شکل 1a میں ہے۔c SPACA6 ایکسٹرا سیلولر ڈومین۔4HB، قبضہ، اور Ig نما ڈومین سٹرپ چارٹ بالترتیب نارنجی، سبز اور نیلے رنگ کے ہیں۔پرتیں پیمانے پر نہیں کھینچی جاتی ہیں۔
SPACA6 کے 4HB ڈومین میں چار اہم ہیلیکس (ہیلیسس 1–4) شامل ہیں، جو ایک ہیلیکل ہیلکس (تصویر 2a) کی شکل میں ترتیب دی گئی ہیں، متوازی اور متوازی تعاملات (تصویر 2b) کے درمیان ردوبدل۔ایک چھوٹا سا اضافی سنگل ٹرن ہیلکس (ہیلکس 1′) بنڈل پر کھڑا ہوتا ہے، جو ہیلیکس 1 اور 2 کے ساتھ ایک مثلث بناتا ہے۔ یہ مثلث ہیلیکس 3 اور 4 کی نسبتاً گھنی پیکنگ کی ہیلیکل بٹی ہوئی پیکنگ میں قدرے بگڑی ہوئی ہے۔ تصویر 2a)۔
4HB N-ٹرمینل پٹی چارٹ۔b چار ہیلیکس کے بنڈل کا سب سے اوپر کا منظر، ہر ہیلکس N-ٹرمینس پر گہرے نیلے اور C-ٹرمینس پر گہرے سرخ رنگ میں نمایاں ہے۔c 4HB کے لیے ٹاپ-ڈاؤن سرپل وہیل ڈایاگرام، جس میں ہر باقیات کو ایک دائرے کے طور پر دکھایا گیا ہے جس کا لیبل ایک حرفی امینو ایسڈ کوڈ ہے۔وہیل کے اوپری حصے میں صرف چار امینو ایسڈ کو نمبر دیا گیا ہے۔غیر قطبی باقیات کا رنگ پیلا ہوتا ہے، قطبی غیر چارج شدہ اوشیشوں کا رنگ سبز ہوتا ہے، مثبت چارج شدہ باقیات کا رنگ نیلا ہوتا ہے، اور منفی چارج شدہ باقیات سرخ رنگ کے ہوتے ہیں۔d 4HB ڈومین کے تکونی چہرے، نارنجی میں 4HB اور سبز رنگ میں قلابے۔دونوں انسیٹ چھڑی کے سائز کے ڈسلفائیڈ بانڈز دکھاتے ہیں۔
4HB ایک اندرونی ہائیڈروفوبک کور پر مرکوز ہے جو بنیادی طور پر aliphatic اور خوشبودار باقیات (تصویر 2c) پر مشتمل ہے۔کور Cys41 اور Cys55 کے درمیان ایک ڈسلفائیڈ بانڈ پر مشتمل ہے جو ہیلائسز 1 اور 2 کو ایک اوپری اوپری مثلث میں جوڑتا ہے (تصویر 2d)۔ہیلکس 1′ میں CXXC موٹف کے درمیان دو اضافی ڈسلفائیڈ بانڈز بنائے گئے تھے اور ایک اور CXXC موٹف جو قبضہ والے علاقے میں β-ہیئرپین کی نوک پر پایا گیا تھا (تصویر 2d)۔ایک نامعلوم فنکشن (Arg37) کے ساتھ ایک قدامت پسند ارجینائن باقیات ایک کھوکھلی مثلث کے اندر واقع ہے جو ہیلیکس 1′، 1، اور 2 سے تشکیل پاتا ہے۔ الیفاٹک کاربن ایٹم Cβ، Cγ، اور Cδ Arg37 ہائیڈروفوبک کور کے ساتھ تعامل کرتے ہیں، اور اس کے گوانیڈائن گروپس چکرا کر حرکت کرتے ہیں۔ ہیلیکس 1′ اور 1 کے درمیان Thr32 ریڑھ کی ہڈی اور سائیڈ چین (تصویر S5a,b) کے درمیان تعامل کے ذریعے۔Tyr34 دو چھوٹے گہاوں کو چھوڑ کر گہا میں پھیلا ہوا ہے جس کے ذریعے Arg37 سالوینٹ کے ساتھ تعامل کرسکتا ہے۔
Ig جیسے β-sandwich ڈومینز پروٹینوں کا ایک بڑا خاندان ہے جو دو یا دو سے زیادہ ملٹی اسٹرینڈڈ amphipathic β-sheets کی مشترکہ خصوصیت کو ایک ہائیڈروفوبک کور 39 کے ذریعے تعامل کرتا ہے۔ اور دو تہوں پر مشتمل ہے (تصویر S6a)۔شیٹ 1 چار اسٹرینڈز کی ایک β-شیٹ ہے (اسٹرینڈز D، F، H، اور I) جہاں اسٹرینڈز F, H، اور I ایک متوازی مخالف ترتیب بناتے ہیں، اور اسٹرینڈز I اور D متوازی تعامل کرتے ہیں۔جدول 2 ایک چھوٹی اینٹی متوازی ڈبل سٹرینڈڈ بیٹا شیٹ ہے (اسٹرینڈز E اور G)۔E چین کے C-ٹرمینس اور H چین (Cys170-Cys226) (تصویر S6b) کے درمیان ایک اندرونی ڈسلفائیڈ بانڈ دیکھا گیا۔یہ ڈسلفائیڈ بانڈ امیونوگلوبلین 40,41 کے β-سینڈوچ ڈومین میں ڈسلفائیڈ بانڈ کے مشابہ ہے۔
چار اسٹرینڈ β-شیٹ اپنی پوری لمبائی کے ساتھ مڑتی ہے، غیر متناسب کناروں کی تشکیل کرتی ہے جو شکل اور الیکٹرو سٹیٹکس میں مختلف ہوتے ہیں۔پتلا کنارہ ایک فلیٹ ہائیڈروفوبک ماحولیاتی سطح ہے جو SPACA6 (تصویر S6b,c) میں باقی ناہموار اور الیکٹرو سٹیٹلی متنوع سطحوں کے مقابلے میں نمایاں ہے۔ریڑھ کی ہڈی کے بے نقاب کاربونیل/امائنو گروپس اور قطبی سائیڈ چینز کا ہالہ ہائیڈروفوبک سطح (تصویر S6c) کو گھیرے ہوئے ہے۔وسیع حاشیہ کو ایک کیپڈ ہیلیکل سیگمنٹ سے ڈھکا ہوا ہے جو ہائیڈروفوبک کور کے N-ٹرمینل حصے کو روکتا ہے اور F چین بیک بون (تصویر S6d) کے کھلے قطبی گروپ کے ساتھ تین ہائیڈروجن بانڈ بناتا ہے۔اس کنارے کا سی ٹرمینل حصہ جزوی طور پر بے نقاب ہائیڈروفوبک کور کے ساتھ ایک بڑی جیب بناتا ہے۔دوہری ارجنائن کی باقیات (Arg162-Arg221، Arg201-Arg205 اور Arg212-Arg214) اور ایک مرکزی ہسٹیڈائن (His220) (شکل S6e) کی وجہ سے جیب مثبت چارجز سے گھری ہوئی ہے۔
قبضہ کا علاقہ ہیلیکل ڈومین اور Ig نما ڈومین کے درمیان ایک مختصر سیگمنٹ ہے، جس میں ایک متوازی تین پھنسے ہوئے β-پرت (اسٹرینڈز A، B اور C)، ایک چھوٹا 310 ہیلکس، اور کئی لمبے بے ترتیب ہیلیکل سیگمنٹس پر مشتمل ہے۔(تصویر S7)۔قبضہ کے علاقے میں ہم آہنگی اور الیکٹرو اسٹاٹک رابطوں کا ایک نیٹ ورک 4HB اور Ig جیسے ڈومین کے درمیان واقفیت کو مستحکم کرتا دکھائی دیتا ہے۔نیٹ ورک کو تین حصوں میں تقسیم کیا جا سکتا ہے۔پہلے حصے میں دو CXXC motifs (27CXXC30 اور 139CXXC142) شامل ہیں جو قبضے میں β-ہیئرپین اور 4HB میں 1′ ہیلکس کے درمیان ڈسلفائیڈ بانڈز کا ایک جوڑا بناتے ہیں۔دوسرے حصے میں Ig جیسے ڈومین اور قبضے کے درمیان الیکٹرو اسٹاٹک تعاملات شامل ہیں۔قبضہ میں Glu132 Ig جیسے ڈومین میں Arg233 اور قبضے میں Arg135 کے ساتھ نمک کا پل بناتا ہے۔تیسرے حصے میں آئی جی جیسے ڈومین اور قبضہ والے علاقے کے درمیان ایک ہم آہنگی بانڈ شامل ہے۔دو ڈسلفائیڈ بانڈز (Cys124-Cys147 اور Cys128-Cys153) قبضے کے لوپ کو ایک لنکر سے جوڑتے ہیں جو Gln131 اور بیک بون فنکشنل گروپ کے درمیان الیکٹرو سٹیٹک تعاملات کے ذریعے مستحکم ہوتا ہے، جس سے پہلے Ig جیسے ڈومین تک رسائی حاصل ہوتی ہے۔زنجیر
SPACA6 ایکٹوڈومین کی ساخت اور 4HB اور Ig جیسے ڈومینز کے انفرادی ڈھانچے کو پروٹین ڈیٹا بیس 42 میں ساختی طور پر ملتے جلتے ریکارڈز تلاش کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ہم نے اعلی Dali Z اسکورز، چھوٹے معیاری انحراف، اور بڑے LALI اسکورز کے ساتھ میچوں کی نشاندہی کی (بعد ازاں ساختی طور پر مساوی باقیات کی تعداد)۔جب کہ مکمل ایکٹوڈومین سرچ (ٹیبل S1) کی پہلی 10 ہٹس کا ایک قابل قبول Z-اسکور >842 تھا، صرف 4HB یا Ig جیسے ڈومین کی تلاش سے معلوم ہوا کہ ان میں سے زیادہ تر ہٹ صرف β-sandwiches کے مساوی ہیں۔بہت سے پروٹینوں میں پایا جانے والا ایک ہر جگہ تہہ۔Dali میں تینوں تلاشوں کا صرف ایک نتیجہ آیا: IZUMO1۔
یہ طویل عرصے سے تجویز کیا گیا ہے کہ SPACA6 اور IZUMO1 میں ساختی مماثلتیں 7,32,37 ہیں۔اگرچہ ان دو گیمیٹ فیوژن سے وابستہ پروٹینوں کے ایکٹوڈومینز صرف 21% تسلسل شناخت (فگر S8a) کا اشتراک کرتے ہیں، لیکن پیچیدہ شواہد، بشمول ایک محفوظ ڈسلفائیڈ بانڈ پیٹرن اور SPACA6 میں ایک پیش گوئی شدہ C-ٹرمینل Ig نما ڈومین، نے ابتدائی کوششوں کی اجازت دی IZUMO1 کو بطور ٹیمپلیٹ37 استعمال کرتے ہوئے A ایک SPACA6 ماؤس کا ہومولوجی ماڈل۔ہماری ساخت ان پیشین گوئیوں کی تصدیق کرتی ہے اور مماثلت کی حقیقی ڈگری کو ظاہر کرتی ہے۔درحقیقت، SPACA6 اور IZUMO137,43,44 ڈھانچے ایک ہی دو ڈومین فن تعمیر (تصویر S8b) کے ساتھ ملتے جلتے 4HB اور Ig جیسے β-سینڈوچ ڈومینز کا اشتراک کرتے ہیں جو قبضہ والے علاقے (تصویر S8c) سے جڑے ہوئے ہیں۔
IZUMO1 اور SPACA6 4HB میں روایتی سرپل بنڈلوں سے عام فرق ہے۔عام 4HBs، جیسا کہ انڈوسومل فیوژن 45,46 میں شامل SNARE پروٹین کمپلیکس میں پائے جاتے ہیں، یکساں طور پر فاصلہ والی ہیلائسز ہیں جو ایک مرکزی محور 47 کے گرد مستقل گھماؤ کو برقرار رکھتے ہیں۔ ناہموار پیکنگ (فگر S8d)۔موڑ، غالباً ہیلیکس 1′، 1 اور 2 سے بننے والے مثلث کی وجہ سے ہوتا ہے، IZUMO1 اور SPACA6 میں برقرار رہتا ہے اور ہیلکس 1′ پر اسی CXXC شکل سے مستحکم ہوتا ہے۔تاہم، SPACA6 میں پایا جانے والا اضافی ڈسلفائیڈ بانڈ (Cys41 اور Cys55 covalently helices 1 اور 2 کو اوپر جوڑتا ہے) مثلث کی چوٹی پر ایک تیز چوٹی بناتا ہے، SPACA6 کو IZUMO1 سے زیادہ گھما دیتا ہے، زیادہ واضح گہا تکون کے ساتھ۔اس کے علاوہ، IZUMO1 میں Arg37 کی کمی ہے جو SPACA6 میں اس گہا کے مرکز میں مشاہدہ کیا گیا ہے۔اس کے برعکس، IZUMO1 میں الیفاٹک اور خوشبودار باقیات کا زیادہ عام ہائیڈروفوبک کور ہے۔
IZUMO1 کے پاس Ig جیسا ڈومین ہے جس میں ڈبل پھنسے ہوئے اور پانچ پھنسے ہوئے β-sheet43 شامل ہیں۔IZUMO1 میں اضافی اسٹرینڈ SPACA6 میں کوائل کی جگہ لے لیتا ہے، جو اسٹرینڈ میں بیک بون ہائیڈروجن بانڈز کو محدود کرنے کے لیے F اسٹرینڈ کے ساتھ تعامل کرتا ہے۔موازنہ کا ایک دلچسپ نقطہ دو پروٹینوں کے Ig جیسے ڈومینز کی پیش گوئی شدہ سطح کا چارج ہے۔IZUMO1 سطح SPACA6 سطح سے زیادہ منفی چارج کی جاتی ہے۔ایک اضافی چارج سی ٹرمینس کے قریب واقع ہے جس کا سامنا سپرم کی جھلی ہے۔SPACA6 میں، وہی علاقے زیادہ غیر جانبدار یا مثبت چارج کیے گئے تھے (تصویر S8e)۔مثال کے طور پر، SPACA6 میں ہائیڈروفوبک سطح (پتلے کنارے) اور مثبت چارج شدہ گڑھے (وسیع کناروں) کو IZUMO1 میں منفی طور پر چارج کیا جاتا ہے۔
اگرچہ IZUMO1 اور SPACA6 کے درمیان تعلق اور ثانوی ساخت کے عناصر کو اچھی طرح سے محفوظ کیا گیا ہے، لیکن Ig جیسے ڈومینز کی ساختی صف بندی نے ظاہر کیا کہ دونوں ڈومینز ایک دوسرے کی نسبت اپنی عمومی واقفیت میں مختلف ہیں (تصویر S9)۔IZUMO1 کا سرپل بنڈل β-سینڈوچ کے بارے میں مڑا ہوا ہے، جو مرکزی محور سے تقریباً 50° پر پہلے بیان کردہ "بومرانگ" شکل بناتا ہے۔اس کے برعکس، SPACA6 میں ہیلیکل بیم تقریباً 10° مخالف سمت میں جھکا ہوا تھا۔ان واقفیت میں فرق ممکنہ طور پر قبضے کے علاقے میں اختلافات کی وجہ سے ہے۔بنیادی ترتیب کی سطح پر، IZUMO1 اور SPACA6 قبضے میں تھوڑی سی ترتیب مماثلت رکھتے ہیں، سوائے سسٹین، گلائسین، اور ایسپارٹک ایسڈ کی باقیات کے۔نتیجے کے طور پر، ہائیڈروجن بانڈز اور الیکٹرو سٹیٹک نیٹ ورک بالکل مختلف ہیں۔β-شیٹ کے ثانوی ڈھانچے کے عناصر IZUMO1 اور SPACA6 کے ذریعے مشترکہ ہیں، حالانکہ IZUMO1 میں زنجیریں زیادہ لمبی ہیں اور 310 ہیلکس (ہیلکس 5) SPACA6 سے منفرد ہے۔ان اختلافات کے نتیجے میں دو دوسری صورت میں ملتے جلتے پروٹینوں کے لیے مختلف ڈومین واقفیت ہوتی ہے۔
ہمارے Dali سرور کی تلاش نے انکشاف کیا کہ SPACA6 اور IZUMO1 صرف دو تجرباتی طور پر طے شدہ ڈھانچے ہیں جو پروٹین ڈیٹا بیس میں محفوظ ہیں جن میں یہ مخصوص 4HB فولڈ (ٹیبل S1) ہے۔ابھی حال ہی میں، ڈیپ مائنڈ (الفابیٹ/گوگل) نے الفا فولڈ تیار کیا ہے، جو ایک عصبی نیٹ ورک پر مبنی نظام ہے جو بنیادی ترتیب سے پروٹین کے 3D ڈھانچے کی درست پیش گوئی کر سکتا ہے۔SPACA6 ڈھانچے کو حل کرنے کے تھوڑی دیر بعد، الفا فولڈ ڈیٹا بیس جاری کیا گیا، جو انسانی پروٹوم 48,49 میں موجود تمام پروٹینوں کے 98.5٪ پر محیط پیش گوئی کرنے والے ڈھانچے کے ماڈل فراہم کرتا ہے۔ہمارے حل شدہ SPACA6 ڈھانچے کو بطور سرچ ماڈل استعمال کرتے ہوئے، الفا فولڈ ہیومن پروٹوم میں ماڈل کے لیے ساختی ہومولوجی کی تلاش نے SPACA6 اور IZUMO1 سے ممکنہ ساختی مماثلت والے امیدواروں کی نشاندہی کی۔SPACA6 (تصویر S10a) کی پیشین گوئی کرنے میں AlphaFold کی ناقابل یقین درستگی کو دیکھتے ہوئے—خاص طور پر ہمارے حل شدہ ڈھانچے (Fig. S10b) کے مقابلے میں 1.1 Å rms ایکٹوڈومین — ہم یقین کر سکتے ہیں کہ شناخت شدہ SPACA6 میچز درست ہونے کا امکان ہے۔
اس سے پہلے، PSI-BLAST نے IZUMO1 کلسٹر کو تین دیگر سپرم سے وابستہ پروٹین کے ساتھ تلاش کیا: IZUMO2، IZUMO3، اور IZUMO450۔الفا فولڈ نے پیش گوئی کی ہے کہ یہ IZUMO فیملی پروٹینز 4HB ڈومین میں IZUMO1 (اعداد و شمار 3a اور S11) جیسے ڈسلفائیڈ بانڈ پیٹرن کے ساتھ فولڈ ہوتے ہیں، حالانکہ ان میں Ig نما ڈومین کی کمی ہے۔یہ قیاس کیا جاتا ہے کہ IZUMO2 اور IZUMO3 IZUMO1 کی طرح یک طرفہ جھلی پروٹین ہیں، جبکہ IZUMO4 چھپے ہوئے دکھائی دیتے ہیں۔گیمیٹ فیوژن میں IZUMO 2، 3، اور 4 پروٹین کے افعال کا تعین نہیں کیا گیا ہے۔IZUMO3 نطفہ کی نشوونما کے دوران acrosome biogenesis میں ایک کردار ادا کرنے کے لیے جانا جاتا ہے51 اور IZUMO پروٹین کو ایک کمپلیکس50 بنانے کے لیے پایا گیا ہے۔ستنداریوں، رینگنے والے جانوروں اور امبیبیئنز میں IZUMO پروٹین کا تحفظ بتاتا ہے کہ ان کا ممکنہ فعل دیگر معروف گیمیٹ فیوژن سے وابستہ پروٹین، جیسے DCST1/2، SOF1، اور FIMP کے ساتھ مطابقت رکھتا ہے۔
بالترتیب نارنجی، سبز اور نیلے رنگ میں ہائی لائٹ کیے گئے 4HB، ہنگ، اور Ig جیسے ڈومینز کے ساتھ IST کے ڈومین فن تعمیر کا خاکہ سپر فیملی۔IZUMO4 کا ایک منفرد سی ٹرمینل علاقہ ہے جو سیاہ نظر آتا ہے۔تصدیق شدہ اور پوٹیٹیو ڈسلفائیڈ بانڈز کو بالترتیب ٹھوس اور نقطے والی لکیروں سے دکھایا گیا ہے۔b IZUMO1 (PDB: 5F4E)، SPACA6، IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1)، IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1)، IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYLF1-F1)، اور AlphaFold DB DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) پینل A کے رنگ کی حد میں دکھائے جاتے ہیں۔ ڈسلفائیڈ بانڈز مینجٹا میں دکھائے جاتے ہیں۔TMEM95، IZUMO2 اور IZUMO3 ٹرانس میمبرین ہیلیس نہیں دکھائے گئے ہیں۔
IZUMO پروٹین کے برعکس، دیگر SPACA پروٹین (یعنی SPACA1، SPACA3، SPACA4، SPACA5، اور SPACA9) SPACA6 (تصویر S12) سے ساختی طور پر مختلف سمجھے جاتے ہیں۔صرف SPACA9 میں 4HB ہے، لیکن اس میں SPACA6 جیسا متوازی-اینٹی-متوازی واقفیت یا وہی ڈسلفائیڈ بانڈ ہونے کی توقع نہیں ہے۔صرف SPACA1 میں ایک جیسا Ig جیسا ڈومین ہے۔الفا فولڈ نے پیش گوئی کی ہے کہ SPACA3، SPACA4 اور SPACA5 کی ساخت SPACA6 سے بالکل مختلف ہے۔دلچسپ بات یہ ہے کہ SPACA4 کو فرٹلائزیشن میں کردار ادا کرنے کے لیے بھی جانا جاتا ہے، لیکن SPACA6 سے زیادہ حد تک، اس کے بجائے سپرم اور oocyte zona pellucida52 کے درمیان تعامل کی سہولت فراہم کرتا ہے۔
ہماری AlphaFold تلاش کو IZUMO1 اور SPACA6 4HB، TMEM95 کے لیے ایک اور مماثلت ملی۔TMEM95، ایک واحد سپرم کے لیے مخصوص ٹرانس میبرن پروٹین، نر چوہوں کو بانجھ بنا دیتا ہے جب 32,33 کو ختم کیا جائے۔TMEM95 کی کمی والے سپرمیٹوزوا میں معمول کی شکل، حرکت، اور زونا پیلوسیڈا میں گھسنے اور انڈے کی جھلی سے منسلک ہونے کی صلاحیت تھی، لیکن وہ oocyte جھلی کے ساتھ فیوز نہیں ہو سکتے تھے۔پچھلے مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ TMEM95 IZUMO133 کے ساتھ ساختی مماثلت رکھتا ہے۔درحقیقت، الفا فولڈ ماڈل نے تصدیق کی کہ TMEM95 ایک 4HB ہے جس میں IZUMO1 اور SPACA6 جیسے CXXC نقشوں کا ایک ہی جوڑا ہے اور SPACA6 (تصویر 3a اور S11) میں پائے جانے والے ہیلائسز 1 اور 2 کے درمیان وہی اضافی ڈسلفائیڈ بانڈ ہے۔اگرچہ TMEM95 میں Ig نما ڈومین کا فقدان ہے، لیکن اس میں SPACA6 اور IZUMO1 قبضہ والے علاقوں (تصویر 3b) کی طرح ڈسلفائیڈ بانڈ پیٹرن والا خطہ ہے۔اس مخطوطہ کی اشاعت کے وقت، پری پرنٹ سرور نے TMEM95 کی ساخت کی اطلاع دی، AlphaFold53 کے نتیجے کی تصدیق کی۔TMEM95 SPACA6 اور IZUMO1 سے بہت مشابہت رکھتا ہے اور ارتقائی طور پر پہلے سے ہی امبیبیئنز (تصویر 4 اور S13) میں محفوظ ہے۔
PSI-BLAST تلاش نے NCBI SPACA6، IZUMO1-4، TMEM95، DCST1، DCST2، FIMP، اور SOF1 ڈیٹا بیس کا استعمال کیا تاکہ زندگی کے درخت میں ان ترتیبوں کی پوزیشن کا تعین کیا جا سکے۔برانچ پوائنٹس کے درمیان فاصلوں کو پیمانے پر نہیں دکھایا گیا ہے۔
SPACA6 اور IZUMO1 کے درمیان نمایاں مجموعی ساختی مماثلت بتاتی ہے کہ وہ ایک محفوظ ساختی سپر فیملی کے بانی ممبر ہیں جس میں TMEM95 اور IZUMO 2، 3، اور 4 پروٹین شامل ہیں۔معروف اراکین: IZUMO1، SPACA6 اور TMEM95۔چونکہ صرف چند ممبران کے پاس Ig جیسے ڈومینز ہیں، اس لیے IST سپر فیملی کا خاصہ 4HB ڈومین ہے، جس میں ان تمام پروٹینز کے لیے انوکھی خصوصیات مشترک ہیں: 1) کوائلڈ 4HB ہیلیکس کے ساتھ متوازی/متوازی الٹرنیشن (تصویر 1) میں ترتیب دی گئی ہے۔ 5a)، 2) بنڈل کا سہ رخی چہرہ ہے جس میں بنڈل کے اندر دو ہیلیکس ہیں اور ایک تیسرا عمودی ہیلکس (تصویر کا کلیدی علاقہ (تصویر 5c)۔ CXXC شکل، تھیوریڈوکسین جیسے پروٹین میں پایا جاتا ہے، کام کرنے کے لیے جانا جاتا ہے۔ ریڈوکس سینسر کے طور پر 54,55,56، جبکہ IST خاندان کے افراد میں موٹف پروٹین ڈسلفائیڈ آئسومیراسز جیسے کہ گیمیٹ فیوژن میں ERp57 کے ساتھ منسلک کیا جا سکتا ہے۔ کردار 57,58 سے وابستہ ہیں۔
IST سپر فیملی کے ممبران کی تعریف 4HB ڈومین کی تین خصوصیت سے کی گئی ہے: متوازی اور متوازی سمت کے درمیان چار ہیلیکس باری باری، ba-triangular helical bundle faces، اور ca CXXC ڈبل موٹیف چھوٹے مالیکیولز کے درمیان بنتا ہے۔) N-ٹرمینل ہیلکس (اورینج) اور قبضہ کا علاقہ β-ہیئرپین (سبز)۔
SPACA6 اور IZUMO1 کے درمیان مماثلت کے پیش نظر، IZUMO1 یا JUNO سے منسلک ہونے کی سابقہ ​​صلاحیت کی جانچ کی گئی۔Biolayer interferometry (BLI) ایک کائنےٹک پر مبنی بائنڈنگ طریقہ ہے جو پہلے IZUMO1 اور JUNO کے درمیان تعامل کی مقدار درست کرنے کے لیے استعمال ہوتا رہا ہے۔IZUMO1 کے ساتھ بائیوٹن کے لیبل والے سینسر کو JUNO تجزیہ کار کے اعلیٰ ارتکاز کے ساتھ بیت کے طور پر انکیوبیشن کرنے کے بعد، ایک مضبوط سگنل کا پتہ چلا (تصویر S14a)، جو سینسر کی نوک سے منسلک بائیو میٹریل کی موٹائی میں بائنڈنگ-حوصلہ افزائی تبدیلی کی نشاندہی کرتا ہے۔ملتے جلتے اشارے (یعنی، JUNO IZUMO1 تجزیہ کار کے خلاف ایک بیت کے طور پر سینسر کے ساتھ جوڑا گیا) (تصویر S14b)۔جب SPACA6 کو سینسر سے منسلک IZUMO1 یا سینسر سے منسلک JUNO (Figure S14a,b) کے خلاف تجزیہ کار کے طور پر استعمال کیا گیا تو کوئی سگنل نہیں ملا۔اس سگنل کی عدم موجودگی اس بات کی نشاندہی کرتی ہے کہ SPACA6 کا ایکسٹرا سیلولر ڈومین IZUMO1 یا JUNO کے ایکسٹرا سیلولر ڈومین کے ساتھ تعامل نہیں کرتا ہے۔
چونکہ بی ایل آئی پرکھ بیت پروٹین پر مفت لائسین کی باقیات کے بایوٹینیلیشن پر مبنی ہے، اس لیے یہ ترمیم بائنڈنگ کو روک سکتی ہے اگر لائسین کی باقیات تعامل میں شامل ہوں۔اس کے علاوہ، سینسر کی نسبت بائنڈنگ کی واقفیت سٹرک رکاوٹیں پیدا کر سکتی ہے، اس لیے روایتی پل-ڈاؤن اسیسز بھی ریکومبیننٹ SPACA6، IZUMO1 اور JUNO ایکٹوڈومینز پر کیے گئے۔اس کے باوجود، SPACA6 نے اس کے ٹیگ شدہ IZUMO1 یا اس کے ٹیگ کردہ JUNO (تصویر S14c,d) کے ساتھ کوئی تعامل نہیں کیا، جو کہ BLI تجربات میں مشاہدہ کے مطابق کوئی تعامل ظاہر نہیں کرتا ہے۔ایک مثبت کنٹرول کے طور پر، ہم نے JUNO کے اس IZUMO1 کے ساتھ تعامل کی تصدیق کی (اعداد و شمار S14e اور S15)۔
SPACA6 اور IZUMO1 کے درمیان ساختی مماثلت کے باوجود، SPACA6 کی JUNO کو باندھنے میں ناکامی حیران کن نہیں ہے۔انسانی IZUMO1 کی سطح پر 20 سے زیادہ باقیات ہیں جو JUNO کے ساتھ تعامل کرتے ہیں، بشمول تینوں خطوں میں سے ہر ایک کی باقیات (اگرچہ ان میں سے زیادہ تر قبضہ والے علاقے میں واقع ہیں) (تصویر S14f)۔ان باقیات میں سے، صرف ایک SPACA6 (Glu70) میں محفوظ ہے۔جب کہ بہت سے باقیات کے متبادل نے اپنی اصل حیاتیاتی کیمیائی خصوصیات کو برقرار رکھا، IZUMO1 میں ضروری Arg160 باقیات کو SPACA6 میں منفی چارج شدہ Asp148 سے بدل دیا گیا۔پچھلے مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ IZUMO1 میں Arg160Glu تغیر JUNO43 کے پابند ہونے کو تقریباً مکمل طور پر ختم کر دیتا ہے۔اس کے علاوہ، IZUMO1 اور SPACA6 کے درمیان ڈومین واقفیت میں فرق نے SPACA6 (تصویر S14g) پر مساوی علاقے کے JUNO-بائنڈنگ سائٹ کی سطح کے رقبے میں نمایاں اضافہ کیا۔
گیمیٹ فیوژن کے لیے SPACA6 کی معلوم ضرورت اور IZUMO1 سے اس کی مماثلت کے باوجود، SPACA6 میں JUNO بائنڈنگ فنکشن کے برابر دکھائی نہیں دیتا ہے۔لہذا، ہم نے ارتقائی حیاتیات کے ذریعہ فراہم کردہ اہمیت کے ثبوت کے ساتھ اپنے ساختی اعداد و شمار کو یکجا کرنے کی کوشش کی ہے۔SPACA6 ہومولوگس کی ترتیب کی سیدھ ممالیہ جانوروں سے باہر مشترکہ ساخت کے تحفظ کو ظاہر کرتی ہے۔مثال کے طور پر، سیسٹین کی باقیات دور دراز سے متعلق امفیبیئنز (تصویر 6a) میں بھی موجود ہیں۔ConSurf سرور کا استعمال کرتے ہوئے، SPACA6 کی سطح پر 66 ترتیبوں کے ایک سے زیادہ سیکوینس الائنمنٹ ریٹینشن ڈیٹا کو میپ کیا گیا تھا۔اس قسم کا تجزیہ یہ دکھا سکتا ہے کہ پروٹین کے ارتقاء کے دوران کون سے باقیات کو محفوظ کیا گیا ہے اور اس بات کی نشاندہی کر سکتا ہے کہ کون سے سطحی علاقے کام میں کردار ادا کرتے ہیں۔
CLUSTAL OMEGA کا استعمال کرتے ہوئے تیار کردہ 12 مختلف انواع سے SPACA6 ایکٹوڈومینز کی ترتیب کی سیدھ۔ConSurf تجزیہ کے مطابق، سب سے زیادہ قدامت پسند پوزیشنوں کو نیلے رنگ میں نشان زد کیا گیا ہے۔سیسٹین کی باقیات کو سرخ رنگ میں نمایاں کیا گیا ہے۔ڈومین کی حدود اور ثانوی ساخت کے عناصر سیدھ کے اوپری حصے میں دکھائے گئے ہیں، جہاں تیر β-strands کی نشاندہی کرتے ہیں اور لہریں helices کی نشاندہی کرتی ہیں۔NCBI رسائی کے شناخت کنندگان جن میں ترتیبیں ہیں وہ ہیں: انسان (Homo sapiens, NP_001303901)، مینڈریل (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), capuchin monkey (Cebus mimic, XP_01735996, XP_0173599, XP_0173590360)، ca201360 ہارس، XP_01735960، X2036 وہیل (Orcinus orca3_23 XP_032_034))، بھیڑ (Ovis aries، XP_014955560)، ہاتھی (Loxodonta africana, XP_010585293), کتا (Canis lupus familyis, XP_025277208), چوہا (Mus musculus, NP_001155563)، XP_001555638 611, XP_0318), Platypus, 8) , 61_89 اور Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113)۔نمبر بندی انسانی ترتیب پر مبنی ہے۔b سب سے اوپر 4HB اور نیچے Ig نما ڈومین کے ساتھ SPACA6 ڈھانچے کی سطحی نمائندگی، ConSurf سرور کے تحفظ کے تخمینے پر مبنی رنگ۔بہترین محفوظ حصے نیلے رنگ میں ہیں، اعتدال سے محفوظ حصے سفید میں ہیں، اور سب سے کم محفوظ شدہ حصے پیلے رنگ میں ہیں۔جامنی سیسٹین.انسیٹ لیبل والے پیچ 1، 2 اور 3 میں تین سطحی پیچ جو اعلیٰ سطح کے تحفظ کا مظاہرہ کرتے ہیں دکھائے گئے ہیں۔ ایک 4HB کارٹون اوپر دائیں جانب انسیٹ میں دکھایا گیا ہے (ایک ہی رنگ سکیم)۔
SPACA6 ڈھانچے میں تین انتہائی محفوظ سطح کے علاقے ہیں (تصویر 6b)۔پیچ 1 4HB اور قبضے کے علاقے تک پھیلا ہوا ہے اور اس میں دو محفوظ CXXC ڈسلفائیڈ پل، ایک Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 قبضہ نیٹ ورک (تصویر S7)، اور تین محفوظ شدہ بیرونی خوشبودار باقیات (Phe31, Tyr137, Phe31) شامل ہیں۔Ig نما ڈومین (تصویر S6e) کا ایک وسیع کنارہ، جو سپرم کی سطح پر کئی مثبت چارج شدہ باقیات کی نمائندگی کرتا ہے۔دلچسپ بات یہ ہے کہ اس پیچ میں ایک اینٹی باڈی ایپیٹوپ ہے جسے پہلے SPACA6 30 فنکشن میں مداخلت کرتے ہوئے دکھایا گیا ہے۔علاقہ 3 قبضہ اور Ig جیسے ڈومین کے ایک طرف پھیلا ہوا ہے۔اس خطہ میں محفوظ شدہ پرولینز (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) اور ظاہری قطبی/چارج شدہ باقیات شامل ہیں۔حیرت انگیز طور پر، 4HB کی سطح پر موجود زیادہ تر باقیات انتہائی متغیر ہیں (تصویر 6b)، اگرچہ تہہ SPACA6 ہومولوگ میں محفوظ ہے (جیسا کہ ہائیڈروفوبک بنڈل کور کی قدامت پسندی سے ظاہر ہوتا ہے) اور IST سے بالاتر ہے۔
اگرچہ یہ SPACA6 کا سب سے چھوٹا خطہ ہے جس میں سب سے کم قابل شناخت ثانوی ڈھانچے کے عناصر ہیں، بہت سے قبضے والے خطے کی باقیات (بشمول خطہ 3) SPACA6 ہومولوگس کے درمیان انتہائی محفوظ ہیں، جو اس بات کی نشاندہی کر سکتے ہیں کہ ہیلیکل بنڈل اور β-سینڈوچ کی واقفیت ایک کردار ادا کرتی ہے۔ایک قدامت پسند کے طور پر.تاہم، SPACA6 اور IZUMO1 کے قبضے والے علاقے میں وسیع ہائیڈروجن بانڈنگ اور الیکٹرو سٹیٹک نیٹ ورکس کے باوجود، IZUMO137,43,44 کے متعدد اجازت شدہ ڈھانچے کی سیدھ میں اندرونی لچک کا ثبوت دیکھا جا سکتا ہے۔انفرادی ڈومینز کی سیدھ اچھی طرح سے اوورلیپ ہوئی، لیکن ایک دوسرے کے نسبت ڈومینز کی سمت بندی مرکزی محور سے 50° سے 70° تک مختلف تھی (تصویر S16)۔حل میں SPACA6 کی تعمیری حرکیات کو سمجھنے کے لیے، SAXS تجربات کیے گئے (تصویر S17a،b)۔SPACA6 ایکٹوڈومین کی ابتدائی تعمیر نو ایک راڈ کرسٹل ڈھانچے (تصویر S18) کے مطابق ہے، حالانکہ کریٹکی پلاٹ نے کچھ حد تک لچک دکھائی (تصویر S17b)۔یہ تشکیل IZUMO1 سے متصادم ہے، جس میں غیر پابند پروٹین جالی اور محلول43 دونوں میں بومرانگ شکل اختیار کرتا ہے۔
خاص طور پر لچکدار خطے کی نشاندہی کرنے کے لیے، ہائیڈروجن ڈیوٹیریم ایکسچینج ماس سپیکٹروسکوپی (H-DXMS) SPACA6 پر کی گئی تھی اور اس کا موازنہ IZUMO143 (تصویر 7a،b) پر حاصل کیے گئے ڈیٹا کے ساتھ کیا گیا تھا۔SPACA6 واضح طور پر IZUMO1 سے زیادہ لچکدار ہے، جیسا کہ 100,000 سیکنڈ کے تبادلے کے بعد پورے ڈھانچے میں اعلی ڈیوٹیریم ایکسچینج سے ظاہر ہوتا ہے۔دونوں ڈھانچے میں، قبضے والے علاقے کا C-ٹرمینل حصہ اعلیٰ سطح کے تبادلے کو ظاہر کرتا ہے، جو ممکنہ طور پر ایک دوسرے کے مقابلے میں 4HB اور Ig جیسے ڈومینز کی محدود گردش کی اجازت دیتا ہے۔دلچسپ بات یہ ہے کہ SPACA6 قبضے کا C-ٹرمینل حصہ، جو 147CDLPLDCP154 باقیات پر مشتمل ہے، ایک انتہائی محفوظ خطہ 3 (تصویر 6b) ہے، ممکنہ طور پر اس بات کی نشاندہی کرتا ہے کہ انٹرڈومین لچک SPACA6 کی ایک ارتقائی طور پر محفوظ خصوصیت ہے۔لچکدار تجزیہ کے مطابق، CD تھرمل میلٹ ڈیٹا سے پتہ چلتا ہے کہ SPACA6 (Tm = 51.2°C) IZUMO1 (Tm = 62.9°C) (تصویر S1e اور S19) سے کم مستحکم ہے۔
SPACA6 اور b IZUMO1 کی H-DXMS تصاویر۔ڈیوٹیریم ایکسچینج کا فیصد اشارہ کردہ ٹائم پوائنٹس پر طے کیا گیا تھا۔ہائیڈروجن-ڈیوٹیریم کے تبادلے کی سطح نیلے (10%) سے سرخ (90%) تک میلان پیمانے پر رنگ سے ظاہر ہوتی ہے۔بلیک باکسز زیادہ تبادلے کے علاقوں کی نمائندگی کرتے ہیں۔کرسٹل ڈھانچے میں مشاہدہ کردہ 4HB، قبضہ اور Ig نما ڈومین کی حدود کو بنیادی ترتیب کے اوپر دکھایا گیا ہے۔10 s، 1000 s، اور 100,000 s پر ڈیوٹیریم ایکسچینج لیولز SPACA6 اور IZUMO1 کی شفاف مالیکیولر سطحوں پر لگائے گئے ایک سٹرپ چارٹ پر بنائے گئے تھے۔ڈیوٹیریم ایکسچینج لیول 50% سے نیچے والے ڈھانچے کے حصے سفید رنگ کے ہوتے ہیں۔50% H-DXMS ایکسچینج سے اوپر والے علاقے گریڈیئنٹ اسکیل میں رنگین ہوتے ہیں۔
CRISPR/Cas9 اور ماؤس جین ناک آؤٹ جینیاتی حکمت عملیوں کے استعمال نے سپرم اور انڈے کی بائنڈنگ اور فیوژن کے لیے اہم عوامل کی نشاندہی کی ہے۔IZUMO1-JUNO اور CD9 ڈھانچے کے اچھی خاصی تعامل کے علاوہ، گیمیٹ فیوژن سے وابستہ زیادہ تر پروٹین ساختی اور فعال طور پر خفیہ رہتے ہیں۔SPACA6 کی بایو فزیکل اور ساختی خصوصیات فرٹیلائزیشن کے دوران چپکنے/فیوژن مالیکیولر پہیلی کا ایک اور ٹکڑا ہے۔
SPACA6 اور IST کے دیگر ارکان انتہائی خاندانی طور پر ممالیہ جانوروں کے ساتھ ساتھ انفرادی پرندوں، رینگنے والے جانوروں اور amphibians میں انتہائی محفوظ دکھائی دیتے ہیں۔درحقیقت، یہ خیال کیا جاتا ہے کہ زیبرا فش 59 میں فرٹلائجیشن کے لیے SPACA6 کی بھی ضرورت ہے۔ یہ تقسیم دیگر معروف گیمیٹ فیوژن سے وابستہ پروٹین جیسے DCST134، DCST234، FIMP31، اور SOF132 سے ملتی جلتی ہے، جو تجویز کرتی ہے کہ یہ عوامل HAP2 کی کمی (بھی) ہیں۔ GCS1) پروٹین کے نام سے جانا جاتا ہے جو بہت سے پروٹسٹوں کی اتپریرک سرگرمی کے لئے ذمہ دار ہیں۔، پودے، اور آرتھروپڈس۔فرٹیلائزڈ فیوژن پروٹینز 60، 61۔ SPACA6 اور IZUMO1 کے درمیان مضبوط ساختی مماثلت کے باوجود، ان میں سے کسی ایک پروٹین کو انکوڈنگ کرنے والے جینوں کے ناک آؤٹ کے نتیجے میں نر چوہوں میں بانجھ پن پیدا ہوا، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ گیمیٹ فیوژن میں ان کے افعال نقل نہیں کیے گئے ہیں۔.مزید وسیع طور پر، فیوژن کے آسنجن مرحلے کے لئے ضروری معلوم سپرم پروٹینوں میں سے کوئی بھی بے کار نہیں ہے۔
یہ ایک کھلا سوال ہے کہ آیا SPACA6 (اور IST سپر فیملی کے دیگر ممبران) انٹرگیمیٹک جنکشنز میں حصہ لیتے ہیں، اہم پروٹینوں کو فیوژن پوائنٹس میں بھرتی کرنے کے لیے انٹراگیمیٹک نیٹ ورکس بناتے ہیں، یا شاید fusogens کے طور پر بھی کام کرتے ہیں۔HEK293T خلیوں میں شریک مدافعتی مطالعات سے پوری لمبائی IZUMO1 اور SPACA632 کے درمیان تعامل کا انکشاف ہوا۔تاہم، ہمارے دوبارہ پیدا ہونے والے ایکٹوڈومینز نے وٹرو میں تعامل نہیں کیا، یہ تجویز کرتا ہے کہ نوڈا ایٹ ال میں دیکھا جانے والا تعامل۔دونوں کو تعمیر میں حذف کردیا گیا تھا (IZUMO1 کی سائٹوپلاسمک دم کو نوٹ کریں، جسے فرٹلائجیشن 62 کے لیے غیر ضروری دکھایا گیا ہے)۔متبادل طور پر، IZUMO1 اور/یا SPACA6 کو مخصوص پابند ماحول کی ضرورت ہو سکتی ہے جسے ہم وٹرو میں دوبارہ نہیں بناتے ہیں، جیسے کہ جسمانی طور پر مخصوص کنفارمیشنز یا مالیکیولر کمپلیکس جس میں دوسرے پروٹین ہوتے ہیں (معلوم یا ابھی تک دریافت نہیں ہوا)۔اگرچہ IZUMO1 ایکٹوڈومین کے بارے میں خیال کیا جاتا ہے کہ وہ پیرویٹیلائن اسپیس میں اسپرمیٹوزوا کو انڈے کے ساتھ منسلک کرتا ہے، لیکن SPACA6 ایکٹوڈومین کا مقصد واضح نہیں ہے۔
SPACA6 کی ساخت کئی محفوظ سطحوں کو ظاہر کرتی ہے جو پروٹین-پروٹین کے تعامل میں شامل ہو سکتی ہیں۔CXXC شکل (اوپر نامزد کردہ پیچ 1) سے فوراً ملحق قبضے کے علاقے کے محفوظ حصے میں کئی ظاہری شکل کی خوشبو والی باقیات ہیں جو اکثر بائیو مالیکیولز کے درمیان ہائیڈروفوبک اور π-اسٹیکنگ تعاملات سے وابستہ ہوتے ہیں۔Ig نما ڈومین (علاقہ 2) کے وسیع اطراف انتہائی محفوظ Arg اور اس کی باقیات کے ساتھ ایک مثبت چارج شدہ نالی بناتے ہیں، اور اس خطے کے خلاف اینٹی باڈیز پہلے گیمیٹ فیوژن 30 کو روکنے کے لیے استعمال ہوتی رہی ہیں۔اینٹی باڈی لکیری ایپیٹوپ 212RIRPAQLTHRGTFS225 کو پہچانتی ہے، جس میں چھ میں سے تین ارجنائن کی باقیات ہیں اور انتہائی محفوظ His220۔یہ واضح نہیں ہے کہ یہ خرابی ان مخصوص اوشیشوں کی رکاوٹ یا پورے خطے کی وجہ سے ہے۔β-sandwich کے C-terminus کے قریب اس خلا کا مقام پڑوسی سپرم پروٹین کے ساتھ cis- تعاملات کی نشاندہی کرتا ہے، لیکن oocyte پروٹین کے ساتھ نہیں۔مزید برآں، قبضے کے اندر ایک انتہائی لچکدار پرولین سے بھرپور الجھنا (سائٹ 3) کو برقرار رکھنا پروٹین-پروٹین کے تعامل کی جگہ ہو سکتا ہے یا زیادہ امکان ہے کہ دو ڈومینز کے درمیان لچک برقرار رکھنے کی نشاندہی کرتا ہے۔SPACA6 کے نامعلوم کردار کے لیے صنف اہم ہے۔گیمیٹس کا فیوژن
SPACA6 میں انٹر سیلولر آسنجن پروٹین کی خصوصیات ہیں، بشمول Ig جیسے β-sandwiches۔بہت سے چپکنے والے پروٹینز (مثلاً، کیڈیرنز، انٹیگرینز، ایڈیسنز، اور IZUMO1) ایک یا زیادہ β-سینڈوچ ڈومینز کے حامل ہوتے ہیں جو کہ خلیے کی جھلی سے پروٹین کو ان کے ماحولیاتی اہداف تک بڑھاتے ہیں63,64,65۔SPACA6 کے Ig نما ڈومین میں عام طور پر چپکنے اور ہم آہنگی کے β-sandwiches میں پایا جانے والا ایک نقش بھی ہوتا ہے: β-sandwiches کے سروں پر متوازی اسٹرینڈ کے دوہرے، جنہیں مکینیکل clamps66 کہا جاتا ہے۔یہ خیال کیا جاتا ہے کہ یہ شکل قینچ کی قوتوں کے خلاف مزاحمت کو بڑھاتی ہے، جو کہ انٹر سیلولر تعاملات میں شامل پروٹین کے لیے قیمتی ہے۔تاہم، adhesins کے ساتھ اس مماثلت کے باوجود، فی الحال اس بات کا کوئی ثبوت نہیں ہے کہ SPACA6 انڈے کی سفیدی کے ساتھ تعامل کرتا ہے۔SPACA6 ایکٹوڈومین JUNO سے منسلک ہونے سے قاصر ہے، اور SPACA6 کا اظہار کرنے والے HEK293T خلیات، جیسا کہ یہاں دکھایا گیا ہے، zona 32 کی کمی والے oocytes کے ساتھ مشکل سے تعامل کرتے ہیں۔اگر SPACA6 انٹرگیمیٹک بانڈز قائم کرتا ہے، تو ان تعاملات کے لیے ترجمہ کے بعد کی ترمیم کی ضرورت ہو سکتی ہے یا دوسرے سپرم پروٹینز کے ذریعے مستحکم ہو سکتے ہیں۔مؤخر الذکر مفروضے کی حمایت میں، IZUMO1 کی کمی والا نطفہ oocytes سے جڑا ہوا ہے، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ IZUMO1 کے علاوہ دیگر مالیکیول گیمیٹ آسنجن مرحلہ 27 میں شامل ہیں۔
بہت سے وائرل، سیلولر، اور ڈیولپمنٹ فیوژن پروٹینز میں ایسی خصوصیات ہوتی ہیں جو ان کے فنکشن کی فزوجن کے طور پر پیش گوئی کرتی ہیں۔مثال کے طور پر، وائرل فیوژن گلائکوپروٹینز (کلاس I، II اور III) میں پروٹین کے آخر میں ایک ہائیڈروفوبک فیوژن پیپٹائڈ یا لوپ ہوتا ہے جو میزبان جھلی میں داخل ہوتا ہے۔IZUMO143 کے ہائیڈرو فیلیسیٹی نقشہ اور IST کی ساخت (مقرر اور پیش گوئی) نے انتہائی خاندانی طور پر کوئی واضح ہائیڈروفوبک فیوژن پیپٹائڈ نہیں دکھایا۔اس طرح، اگر IST میں کوئی بھی پروٹین انتہائی خاندانی طور پر fusogens کے طور پر کام کرتا ہے، تو وہ ایسا دوسرے معروف مثالوں سے مختلف انداز میں کرتے ہیں۔
آخر میں، گیمیٹ فیوژن سے وابستہ پروٹینوں کی انتہائی فیملی IST کے ممبران کے افعال ایک معمہ بنے ہوئے ہیں۔ہمارا خصوصیت والا SPACA6 ریکومبیننٹ مالیکیول اور اس کا حل شدہ ڈھانچہ ان مشترکہ ڈھانچے کے درمیان تعلقات اور گیمیٹ اٹیچمنٹ اور فیوژن میں ان کے کردار کے بارے میں بصیرت فراہم کرے گا۔
پیش گوئی شدہ انسانی SPACA6 ایکٹوڈومین (NCBI الحاق نمبر NP_001303901.1؛ اوشیشوں 27–246) کے مطابق DNA ترتیب ڈروسوفلا میلانوگاسٹر S2 خلیات میں اظہار کے لیے کوڈن کے لیے موزوں تھی اور ایک جین تھیکوسکوزامک کے ساتھ ایک جینس کوسنو کے ٹکڑے کے ساتھ ترکیب کیا گیا تھا۔، BiP سراو سگنل اور متعلقہ 5′ اور 3′ اس جین کی ligation سے آزاد کلوننگ کے لیے ایک pMT اظہار ویکٹر میں ختم ہوتا ہے جس کی بنیاد پر میٹالوتھیونین پروموٹر کی بنیاد پر puromycin (pMT-puro) کے ساتھ انتخاب کے لیے ترمیم کی گئی ہے۔pMT-puro ویکٹر تھرومبن کلیویج سائٹ کو انکوڈ کرتا ہے جس کے بعد 10x-His C-ٹرمینل ٹیگ (Figure S2) ہوتا ہے۔
D. melanogaster S2 (Gibco) خلیوں میں SPACA6 pMT-puro ویکٹر کی مستحکم منتقلی IZUMO1 اور JUNO43 کے لیے استعمال ہونے والے پروٹوکول کی طرح ہی انجام دی گئی تھی۔S2 خلیات کو شنائیڈر کے میڈیم (Gibco) میں پگھلا کر اگایا گیا جس کی تکمیل 10% (v/v) ہیٹ سے غیر فعال برانن بچھڑے کے سیرم (Gibco) اور 1X antimycotic antibiotic (Gibco) کے ساتھ کی گئی۔ابتدائی گزرنے والے خلیات (3.0 x 106 خلیات) کو 6 کنویں پلیٹوں (کارننگ) کے انفرادی کنویں میں چڑھایا گیا تھا۔27 ° C پر 24 گھنٹے انکیوبیشن کے بعد، مینوفیکچرر کے پروٹوکول کے مطابق SPACA6 pMT-puro ویکٹر اور Effectene transfection reagent (Qiagen) کے 2 ملی گرام کے مرکب سے خلیات کو تبدیل کیا گیا۔منتقلی شدہ خلیوں کو 72 گھنٹے تک انکیوبیٹ کیا گیا اور پھر 6 ملی گرام/ملی لیٹر پیورومائسن کے ساتھ کاٹا گیا۔اس کے بعد خلیات کو مکمل شنائیڈر میڈیم سے الگ کر دیا گیا اور بڑے پیمانے پر پروٹین کی پیداوار کے لیے سیرم فری Insect-XPRESS میڈیم (لونزا) میں رکھا گیا۔S2 سیل کلچر کا 1 L بیچ 8–10 × 106 ml-1 خلیات میں 2 L ہوادار فلیٹ نیچے والے پولی پروپیلین ایرلن میئر فلاسک میں بڑھایا گیا اور پھر 500 µM CuSO4 (ملی پور سگما) اور جراثیم سے پاک فلٹر کی حتمی حراستی کے ساتھ جراثیم سے پاک کیا گیا۔حوصلہ افزائیحوصلہ افزائی ثقافتوں کو 27 ° C پر 120 rpm پر چار دن تک انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔
SPACA6 پر مشتمل کنڈیشنڈ میڈیم کو سینٹرفیوگریشن کے ذریعے 5660×g 4°C پر الگ کیا گیا تھا جس کے بعد 10 kDa MWCO جھلی کے ساتھ سینٹرمیٹ ٹینجینٹل فلو فلٹریشن سسٹم (Pall Corp) تھا۔SPACA6 پر مشتمل متمرکز میڈیم کو 2 ملی لیٹر Ni-NTA ایگروز رال (کیجین) کالم پر لگائیں۔Ni-NTA رال کو بفر A کے 10 کالم والیوم (CV) سے دھویا گیا اور پھر بفر A کا 1 CV شامل کیا گیا تاکہ 50 ایم ایم کی حتمی امیڈازول ارتکاز ہو سکے۔ایس پی اے سی اے 6 کو 10 ملی لیٹر بفر اے کے ساتھ امیڈازول کے ساتھ 500 ایم ایم کی حتمی حراستی تک بڑھایا گیا تھا۔پابندی کلاس تھرومبن (ملی پور سگما) کو براہ راست ڈائیلاسز ٹیوبنگ (MWCO 12-14 kDa) میں 1 یونٹ فی mg SPACA6 بمقابلہ 1 L 10 mM Tris-HCl، pH 7.5 اور 150 mM NaCl (بفر بی) میں ڈالا گیا۔48 گھنٹے کے لیے 4°C پر۔اس کے بعد تھرومبن کلیویڈ SPACA6 کو نمک کے ارتکاز کو کم کرنے کے لیے تین گنا پتلا کیا گیا اور 10 ملی میٹر Tris-HCl، pH 7.5 کے ساتھ 1 ملی لیٹر مونوس 5/50 GL کیٹیشن ایکسچینج کالم (Cytiva/GE) پر لاد دیا گیا۔کیشن ایکسچینجر کو 10 mM Tris-HCl کے 3 CV، pH 7.5 سے دھویا گیا، پھر SPACA6 کو 10 mM Tris-HCl میں 0 سے 500 mM NaCl کے لکیری میلان کے ساتھ، 25 CV کے لیے pH 7.5 کے ساتھ دھویا گیا۔آئن ایکسچینج کرومیٹوگرافی کے بعد، SPACA6 کو 1 ملی لیٹر تک مرتکز کیا گیا اور ایک ENrich SEC650 10 x 300 کالم (BioRad) سے بفر B کے ساتھ ہم آہنگ کیا گیا۔ کرومیٹوگرام کے مطابق SPACA6 پر مشتمل پول اور کنسنٹریٹ فریکشنز۔پاکیزگی کو 16٪ SDS-polyacrylamide جیل پر Coomassie-stained electrophoresis کے ذریعے کنٹرول کیا گیا تھا۔بیئر لیمبرٹ قانون اور نظریاتی داڑھ کے ختم ہونے کے گتانک کا استعمال کرتے ہوئے 280 nm پر جذب کے ذریعہ پروٹین کی مقدار کو درست کیا گیا۔
پیوریفائیڈ ایس پی اے سی اے 6 کو راتوں رات 10 ایم ایم سوڈیم فاسفیٹ، پی ایچ 7.4 اور 150 ایم ایم این اے ایف کے خلاف ڈائلائز کیا گیا اور سی ڈی اسپیکٹروسکوپی کے تجزیہ سے پہلے 0.16 ملی گرام/ملی لیٹر تک گھٹا دیا گیا۔185 سے 260 nm کی طول موج کے ساتھ CDs کی سپیکٹرل سکیننگ کو Jasco J-1500 اسپیکٹروپولاریمیٹر پر 50 nm/min کی شرح سے 25°C پر 1 ملی میٹر آپٹیکل پاتھ کی لمبائی (ہیلما) کے ساتھ کوارٹز کیویٹ کا استعمال کرتے ہوئے جمع کیا گیا۔سی ڈی سپیکٹرا کو بیس لائن درست کیا گیا، اوسطاً 10 سے زیادہ حصول، اور ڈگری سینٹی میٹر 2/dmol میں بقایا بیضوی (θMRE) میں تبدیل کیا گیا:
جہاں MW Da میں ہر نمونے کا سالماتی وزن ہے۔N امینو ایسڈ کی تعداد ہے۔θ ملی ڈگری میں بیضوی ہے؛d سینٹی میٹر میں نظری راستے کی لمبائی سے مساوی ہے۔یونٹس میں پروٹین کی حراستی